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热激对不同玉米品种生长和物理化学性质的反应
摘 要
本研究旨在评估对比玉米栽培品种PakAfgoi（耐受型）和EV-5098（敏感型）在受热激时的生化反应。 对7日龄幼苗进行不同时间间隔（1,3,6,24,48和72 h）的热激处理，并确定评估玉米各种物理化学属性的数据变化。植物在正常条件下生长5天，记录不同生长因子和光合色素的数据。热激使玉米的生长速度和光合色素的合成减少。当热激3小时的植物在热激减轻时恢复了生长和光合色素。在EV-5098中记录了相对膜透过性，过氧化氢和丙二醛含量随时间上升，表明高温诱导的氧化应激。由于高温热激，不同保护酶的活性大大改变。例如，两个玉米品种都记录到超氧化物歧化酶活性的增加。 Pak-Afgoi中抗坏血酸过氧化物酶的活性更高。但在EV-5098植株中过氧化物酶和过氧化氢酶活性较高。热激引起脯氨酸含量显着增加和总游离氨基酸含量下降。总体而言，Pak-Afgoi的表现较好，具有较低的氧化损伤和更高的脯氨酸细胞水平。结果表明，氧化胁迫指标（相对膜透性，过氧化氢和丙二醛含量）和脯氨酸含量可作为耐热休克植物的标记。
关键词 玉米；抗氧化酶；叶绿素；生长；热激
介 绍
高温（HT）是全球植物生长，代谢和作物生产的潜在威胁。植物生长和发育涉及许多对高温胁迫敏感的生化反应。植物对高温的反应随着程度，持续时间和植物类型而变化（Hasanuzzaman，2013）。全球气温预计每十年上升2.0ordm;C，到本世纪末可能导致温度上升1.8-4.0ordm;C，主要是温室气体排放造成的（IPCC，2007）。随着全球变暖，植物高温损伤正成为一个严重的问题。在小麦，玉米和大麦中，植物产量与高温胁迫之间存在着相关关系（Lobell and Field，2007）。在许多植物物种中，种子萌发，出苗及其生长受到HT的极大影响，例如珍珠粟和玉米（Ashraf and Hafeez，2004）。高温改变了种子组成，种子蛋白质的表达模式，降低了种子的萌发率和活力，因此高温与种子的品质属性存在一定关系（Eglietal，2005）。高温胁迫降低了特定酶的活性，并导致玉米萌发胚中蛋白质的合成减少（Riley，1981）。高温直接改变了光合适应和生理过程，间接改变了发育模式。热激胁迫在不同的作物物种中导致植物生长，发育，生理过程和最终经济产量发生各种各样的且往往严重的变化（Hasanuzzaman，2013）。
高温导致过氧化物（ROS）过度生成，如超氧自由基，单线态氧，过氧化氢和羟基自由基（SavickaandSkute，2010） ，随后引起过氧化反应的增加，饱和脂肪酸减少，以及几种植物物种膜中不饱和脂肪酸含量增加（Rodriguez等，2005）。 ROS是强氧化剂，通过脂质过氧化引起细胞死亡，蛋白质氧化并诱导DNA的实质损伤（Hasanuzzaman，2013）。植物能够通过抗氧化剂防御系统来克服ROS诱导的氧化应激反应。抗氧化系统限制和缓解氧化损伤，并增强对环境压力的抵抗力，这通常与高效抗氧化系统相关。超氧化物歧化酶（SOD），过氧化物酶（POD），过氧化氢酶（CAT），谷胱甘肽过氧化物酶（GPX），抗坏血酸（APX）和谷胱甘肽还原酶（GR）等抗氧化酶的活性是抗氧化防御的重要指标（Chakraborty and Pradhan，2011年）。通过测量电解质的渗漏来评估细胞损伤，以评估现有压力的严重程度（SavickaandSkute，2010）。在高温胁迫下，膜稳定性与产量正相关（Rahman，2009）。为了修复ROS的伤害，植物利用抗氧化防御机制，其包括涉及ROS有关的酶和非酶抗氧化系统。 在各种酶催化下，细胞中SOD将超氧化物转化为过氧化氢。过氧化氢进一步被CAT，APX和其他非酶抗氧化剂（包括类胡萝卜素，抗坏血酸），等清除（Weisany，2012）。
丙二醛（MDA）或硫代巴比妥酸反应物（TBARs）是主要的转运蛋白之一，是生物膜中的多不饱和脂肪酸的分解化合物，并已广泛用作氧化过程的指标（Balakhnina，2005）。此外，耐热植物的MDA水平要高于敏感的植物（Hurkman，2009）。 脯氨酸是一种氨基酸，其含量对不同类型的非生物胁迫响应而增加（Kaushal，2011），在膨压的产生，渗透调节，碳和氮的储存以及细胞的氧化还原电位几个方面有作用。 此外，脯氨酸可以维持酶的结构和活性（Kaushal，2011），从而保护膜的完整性（Hayat，2012）。
玉米是小麦和大米之后的第三种重要谷物。它广泛种植于世界温带，亚热带和热带地区。玉米在28-31℃下表现出最佳生长。作为营养丰富来源遍布全球（71％淀粉，11.1％蛋白质，8.4％纤维和4.6％食用油，4.3％糖和1.3％灰），玉米是食物，可作为糖，乙醇，生物燃料，食用油，玉米淀粉和动物饲料的原料（Iken，2002）。由于温度波动严重阻碍了玉米的生长，因此本实验旨在研究高温对玉米植物生长调节和基础生理调节的影响，探究Pak-Afgoi和EV-5098在育种方面相互关联，此外，Pak-Afgoi比 EV-5098耐受性好，合成新的栽培品种。（Perveen，2013； Rasheed，2015）。因此，本研究的目的是评估热激对玉米耐热性生理化学调节的影响。
材料与方法
从玉米和小米研究所获得了两种遗传多样性玉米品种的种子，即Pak-Afgoi（重金属，温度，耐旱和耐盐）和EV-5098（非生物胁迫敏感）。种子用0.1％HgCl溶液消毒15分钟以避免真菌和其他污染，然后用蒸馏水清洗，然后在装有1公斤沙子的陶罐（尺寸14厘米高，顶部19厘米，底部7厘米）播种。在每个盆中播种10个种子，并分别放置在日夜温度为28℃/ 22℃的植物生长室中。发芽后，确保每个陶罐至少6个健康均匀、大小相等的幼苗。将7日龄玉米幼苗从对照温度范围（28℃/ 22℃，昼/夜）转移至另一个相似的植物生长室内，温度（41℃ / 36℃，白天/夜间）。为了防止干旱胁迫，植物在需要的时候用荷花田的水灌溉，以保持田间持水量。其他生长条件为14 / 10h光照/黑暗期，10000xls光合有效辐射（PAR）和平均相对湿度（64plusmn;4％）。实验的安排是完全随机化的设计，每次处理重复三次。在三天的高温胁迫后，植物在常温下生长，另外在五天的热激后测定不同的生长属性。在高温胁迫的1,3，6，24，48和72小时后对第三个完全成熟的叶进行采样以确定不同时程生理化学属性的变化。
叶片面积为最大叶长times;最大叶宽times;0.68。 在70℃的烘箱中干燥约72小时后，记录茎和根干重。 其他植物样品保存在-20℃的冷却室中。
通过Yoshida等人的方法定量叶绿素a和b（Chl a和b）含量。使用5ml丙酮（80％）将0.1g新鲜叶材磨成匀浆。将上清液用UV-VIS分光光度计测量不同波长（480、645和663nm）处的吸光度。 通过使用Davies（1976）的程序对叶类胡萝卜素进行定量。 根据干重计算叶绿素和总类胡萝卜素含量并表示为mg *g-1。
将叶片放在含有蒸馏水（10ml）的试管中并离心5秒。 测量滤液的电导率（EC）。 然后保温24小时， 将滤液高压灭菌15分钟以测量EC。 根据Yang等人的方程计算离子渗漏的百分比（1996）。
使用Velikova等人的方法测定过氧化氢含量（2000年）。 将新鲜叶组织（0.15g）在1ml TCA（0.1％）（w / v）中研磨。 将均质材料用10000g离心10分钟以收集上清液。 上清液和磷酸钾缓冲液与1ml碘化钾（KI）溶液（各0.5ml）反应。 彻底涡旋混合。 然后使用UV-VIS分光光度计在390nm处记录吸光度，并使用TCA（0.1％）溶液作为空白。 过氧化氢由已知过氧化氢浓度的标准曲线确定，数值表示为mu;mol *g-1。
使用该方法（Heath and Packer，1968）估计丙二醛（MDA）含量。 使用1ml的5％TCA溶液（w / v）使0.1g新鲜叶材均质化。 12000g离心,收集上清液1ml与1ml在0.5％（w / v）TBA中制备的20％TCA反应。 该混合物于95℃水浴加热30分钟。加热后，将混合物在7500g下离心5分钟。 使用TCA（5％）作为空白记录532和600nm处的的吸光度。 用消光系数155000nmol* mol-1计算MDA含量。 根据下式计算MDA浓度：
MDA(nmol*mol-1)=[(A525/600-A)/155000]*106
游离脯氨酸用Bates等人的方法测定（1973年）。 使用3％磺基水杨酸水溶液（5ml）使0.1g新鲜叶研磨均匀。在试管中混合茚三酮（1ml）和冰醋酸（1ml）。 将混合物在100℃加热10分钟并在冰浴中冷却。 加入甲苯（4ml）并振动20秒并冷却以提取混合物。 用紫外分光光度计（Hitachi U-2910）在532nm处测量材料的吸光度，根据已知浓度的标准曲线测定游离脯氨酸含量，以干重（DW）为基础计算游离脯氨酸的量并表达如mu;mol*g-1。
通过使用Hamilton和Van Slyke（1973）的茚三酮法测定总游离氨基酸。 用磷酸盐缓冲液（pH7.0）将0.1克鲜叶材料研磨均匀。取1ml提取物加入25ml试管中，然后在每个试管中加入1ml 10％吡啶和1ml 2％茚三酮溶液。 在水浴中加热试管30分钟。每支试管用蒸馏水定容至50ml，使用UV-VIS分光光度计（Hitachi U-2910，Tokyo，Japan）在570nm测量光密度。 总游离氨基酸的量由Lucine在570nm处的标准曲线计算并表示为mg* g-1。
花青素含量用Hodges和Nozzolillo（1996）的方法。 在研钵中，将新鲜叶片材料（0.1g）在酸化的甲醇（2ml）中研磨均匀。 然后将材料转移到离心管中，并在50℃的水浴中加热1小时。 在离心机中12000g离心15分钟。 通过使用UV-VIS分光光度计（Hitachi U-2910，Tokyo，Japan）在540和600nm处测量吸光度。 在原始样品中计算总花青素含量的量并以mg* g-1。
超氧化物歧化酶（SOD）用Gong等人提供的方法测定。略作修改。反应溶液（3ml）含有50mu;M氮蓝四唑（NBT），1.3mu;M核黄素，13mM甲硫氨酸，75mM乙二胺四乙酸，50mM磷酸钾缓冲液（pH7.8）和20-50ml酶提取。包含反应溶液的试管在光下（15个荧光灯）照射15分钟。使用分光光度计读取560nm处溶液的吸光度。一个单位的SOD活性定义为抑制50％的NBT光还原的酶的量。
根据Cakmark等人的方案测定POD和CAT活性（1993）。反应混合物（3ml）含有愈创木酚（20mM），pH（5.0）的磷酸盐缓冲液（50mM）过氧化氢（40mM）和酶提取物（0.1ml）测定POD。记录2分钟内每20秒钟在470nm处的吸光度变化。以吸光度每分钟减少0.1组为一个POD的活性。 CAT反应混合物（3ml）包括磷酸盐缓冲液（50mM）（pH 7.0），水（5.9mM）和酶提取物（0.1ml）。将酶提取物加入到混合物中以开始反应。在240nm处记录2分钟内每20秒钟的吸光度变化。
通过使用Krivosheeva等人的方法测定玉米叶APX活性（1996）。反应混合物（1ml）包含过氧化氢（0.1mM），磷酸钾缓冲液（50mM）（pH 7.0），抗坏血酸（0.5mM）和酶提取物（200mu;l）。测定混合物在290nm处吸光度减少量，用H2O做空白对照。酶的活性以U / mg蛋白质表示。
使用COSTAT计算机包（Cohort Software，Berkeley，CA，USA）对所有变量的数据进行方差分析（ANOVA）。 将平均值与邓肯多范围检验进行比较（p lt;0.05）。 使用XLSTAT软件确定不同生长和生化属性与高温胁迫的相关性。(Addinsoft SARL，2004）。
结果与讨论
两种玉米品种在不同时期（1,3,6,24,48和72 h）都受到高温胁迫的影响，在不同生长特性（如枝条和根干质量和叶面积上有显着（ple;0.001）的下降表格1）。当暴露于高温6和24小时时，品种Pak-Afgoi具有更大的枝条和根干质量和叶面积，并且高温胁迫72小时后这些属性的最小值是明显的。相比之下，EV-5098在施加高温胁迫24和48小时具有更大的枝条和根干质量，而更高的叶面积在高温胁迫6小时后。总体而言，与Pak-Afgoi相比，EV-5098对高温胁迫的生长属性更敏感（图1）。环境变化，尤其是温度超过最佳温度的变化，可能会严重影响农业环境中的作物生长和生产力。在本研究中，在两个暴露于高温胁迫的玉米品种中观察到芽和根干质量的时间依赖性变化。
结果表明，温度升高可能增加了光合作用，从而最初增加了生长。但是，温度的进一步升高可能会导致蒸发和蒸腾作用的减弱（图1）。水分损失是影响植物代谢活动的主要因素（Iqbal and Ashraf，2010）。
将玉米植株暴露于高温 1 h会增加光合作用色素（叶绿素a和b）和总类胡萝卜素含量，而随后随着植物高温（3,6,24,48和72 h）暴露时间的增加，这些变量一直下降。Pak-Afgoi数据反映出光合色素和类胡萝卜素的最大值在热激1h后。此外，暴露于热激的时间增加导致这两个玉
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