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不同基因型蚕豆在高温胁迫下的形态和生理特征
摘 要
现如今，高温胁迫（HS）已成为制约全世界作物产量的主要因素。在此前提下，本课题欲以十种不同基因型的蚕豆为对象，研究不同温度水平（室温，较高温和高温）对植株高度（PH）/植株，鲜重（FW）和干重（DW）/植株，面积/叶，叶片相对含水量（RWC），脯氨酸含量（Pro）和叶绿素总量（Chl），电解质渗漏量（EL），丙二醛含量（MDA），过氧化氢（H2O2）和过氧化氢酶（CAT ），过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响，从而根据形态生理和生化特性筛选耐受性和敏感性基因型。这些基因型如下：Zafar 1，Zafar 2，Shebam 1，Makamora，Espan，Giza Blanka，Giza 3，C4，C5和G853。结果表明，高温胁迫显著影响所有基因型的生长性能。然而，基因型“C5”减少的幅度相对较低，这可能是由于其更好的抗氧化活性（CAT，POD和SOD）以及Pro和总Chl和叶片RWC的积累，因此“C5”被认为是最耐受高温胁迫的基因型。而“Espan”则对高温胁迫最为敏感。得出的结论是，耐热基因型可以通过增加Pro含量的积累以及增加抗氧化酶的活性而具有更好的渗透调节和防卫自由基的作用。
关键词：高温胁迫；蚕豆；抗氧化系统；脯氨酸；光合色素
1 引言
高温，寒冷，干旱和盐碱是造成当今世界许多地区严重问题的主要环境因素。不断升高的温度不仅是植物生长和产量的限制因素之一，也是植物地理分布的限制因素之一。预计在未来的一个世纪里，植物将受到极其严重的危害，并且由于人为活动所增多的气体，尤其是二氧化碳，甲烷，氯氟烃和氮氧化物，这一危害将更加严重。根据政府间气候变化专门委员会（IPCC）的第四次评估报告，全球平均气温到2100年将上升1.8℃至4℃（Saacute;nchez等，2014）。增长率取决于温室气体的水平，如果人口和全球经济继续以目前的速度增长（Saacute;nchez等，2014），则甚至可能更大。而温度在植物生长，发育，繁殖和产量中起着关键作用（Mittler等，2012）。植物像其他固着生物一样，在高温环境下将会不断暴露于常温以上。全球范围内，由于高温胁迫或伴随着干旱及其他环境因素，农业已经遭受了重创（Mittler，2006）。根据Lobell等（2011）的研究，过去三十年（1980-2008），由于高温胁迫，世界小麦和玉米产量分别下降3.8%和5.5%。同样，2010年小麦价格下跌达50%，原因是超过20%的俄罗斯农业生产区受到了高温胁迫（FAO，2010；NOAA，2011）的影响。奥尔蒂斯等人（2008）报道说，温度上升3-4℃可能会导致非洲和亚洲作物产量损失15-35%，中东损失25-35%。
由于全球变暖，高温胁迫将在形态解剖，生理，生化和分子水平引起植物的一系列变化，导致经济产量的急剧下降。高温胁迫的影响显著存在于种子的发芽到开花的各个阶段，因为植物生命的各个阶段都是温度依赖性的。种子萌发和种子活力受到高温胁迫的不利影响，可导致热伤害或种子死亡（Khan，1976；Grass and Burris，1995）。高温胁迫引起植物的各种生理变化，如叶和茎的焦化，叶片脱落和衰老，枝条和根生长的抑制或花的数量减少，花粉管生长和孢子不育，果实损伤等，并导致作物的严重损失（Bita和Gerats，2013；Teixeira等，2013；Song等，2013；Hemantaranjan等，2014）。高温胁迫还影响光合作用，呼吸作用，水分关系，膜稳定性和激素水平的调节，以及初级和次级代谢产物（Hemantaranjan等，2014）的生成。高温胁迫也可损害叶绿体和线粒体中蛋白质的稳定性，膜完整性，RNA和酶的活性，导致代谢内稳态失衡（Mittler等，2012；Hemantaranjan等，2014）。代谢稳态的紊乱导致有毒副产物例如活性氧（ROS）的积累（Mittler等，2012）。为了在高温胁迫条件下存活或保持代谢过程的稳态平衡，植物则重新编码其转录组，蛋白质组，代谢组和脂质组，从而调整其某些转录物，蛋白质，代谢物和脂质的组成（Mittler等，2012） 。许多热激蛋白（HSP100s，HSP90s，HSP70s，HSP60s，HSP40s和小HSPs（sHSPs））在植物中累积以减轻高温胁迫对植物代谢的不利影响（Singh和Grover，2008；Al-Whaibi，2011；Lavania等，2015a，b）。
高温和干旱胁迫都是植物生长和发育的有害因素。可检测的抑制植物生长的温度被称为阈值温度，其随着植物种类和物种内的基因型的变化而变化（Wahid等，2007；Hemantaranjan等，2014）。确定植物在胁迫下可以存活的阈值温度是很重要的。这对于了解植物对高温胁迫耐受性的生理过程和机制以及改善作物耐热性至关重要。植物对胁迫的生理反应的知识对于使用遗传方法选育抗逆性作物也很重要。蚕豆（Vicia faba L.）是一种重要的豆类作物，但却不宜在干旱和半干旱地区种植，因为这种作物不具有足够的耐干旱和耐热性，它很容易受到水分和高温的影响（Loss和Siddique，1997）。鉴于该作物对人类和动物的重要性，本课题计划研究高温胁迫对不同基因型蚕豆植株的影响，并基于生理形态学和生物化学参数确定高温胁迫耐受性和高温胁迫敏感性基因型。
2 材料和方法
为了达到本研究的目的，收集了十种不同地理来源的改良的蚕豆基因型。基因型Zafar 1，Zafar 2和Shebam1的种子来自也门农业研究总局，基因型Makamora和Espan的种子来自利雅得当地市场，基因型Giza Blanka，Giza 3，C4，C5和G853的种子来自埃及农业研究中心。实验在组培室（温度25plusmn;3℃，相对湿度50-60%，光照为90mu;Mol光子/m-2s-1；6/8h的亮/暗循环）下进行。种子在含有沙子和泥炭混合物（1：1）的盆中生长。在播种60天后进行高温胁迫处理。处理细节如下：（i）对照组（UN）：室温（25℃）；（ii）较高温组（HT1）：比室温高6℃；（iii）高温组（HT2）：比室温高12℃。通过将育苗盆置于各个相应温度下48小时，使植物获得不同温度水平的高温胁迫。
将实验盆安放在一个简单的设计中，每个处理5次重复。播种前，用1%次氯酸钠将所有基因型的种子表面灭菌10分钟，然后用重蒸馏水（DDW）剧烈冲洗，并播种在供应Raukura营养液（Smith等，1983 ）的填充有砂和泥炭的罐中。用于构成营养液的盐如下：大量营养素母液A（gL-1）含有Mg(NO3)2·6H2O，4.94；Ca(NO3)2·4H2O，16.78；NH4NO3，8.48；KNO3，2.28。大量营养素母液B（gL-1）含有 KH2PO4，2.67；K2HPO4，1.64；K2SO4,，6.62；Na2SO4，0.60；NaCl，0.33。微量营养素补充剂（mgL-1）含有H3BO3，128.80；CuCl2·2H2O，4.84；MnCl2·4H2O，81.10；(NH4)6Mo7O24·4H2O,，0.83；ZnCl2，23.45；柠檬酸铁五水合物，809.84。施用于植物的稀释溶液通过将200mL各种大量营养素母液与100mL微量营养素补充剂混合并用DDW稀释至4.5L来制备。
2.1 植物形态特征的测定
高温胁迫处理5天后立即对植物取样以测量生长参数。根据PH/植株，FW和DW/植株和面积/叶评估蚕豆植株的生长性能。使用叶面积测量仪（型号LI-3050A，LI-COR Inc，Lincon，NE，USA）直接测量叶面积，确定每株样品（包含5次重复）的3片叶片（上，中，下）的面积。
2.2 植物生理生化特征的测定
叶片RWC（%）使用Gulen和Eris（2003）的方法测定。从每种处理温度的三株植物（3次重复）的均匀的和完全展开的叶子中取若干叶圆片。首先，记录FW，然后将样品置于具有蒸馏水的培养皿中4小时，随后记录膨胀重量（TW），并将叶样品置于70℃的干燥箱中24小时以测定干重。叶片RWC%的计算通过
RWC%=[(FW-DW)/(turgid weight-dry weight)] times; 100
测定总叶绿素（总Chl）时，使用80%丙酮提取最嫩的完全展开的叶子，并且使用UV-vis分光光度计（SPEKOL 1500；Analytik Jena AG，Jena，Germany）测定663nm和645nm处的吸光度，然后用公式计算总Chl含量（Arnon，1949）。Pro浓度通过使用Bates（1973年）等人的茚三酮分光光度法测定。将新鲜叶片样品在3%磺基水杨酸中匀化，然后分别加入2mL茚三酮和冰醋酸，将样品加热至100℃后用甲苯萃取混合物，萃取液在520nm处测定吸光度值。丙二醛（MDA）含量根据Heath和Packer（1968）的方法进行测定。称取叶片样品，将含有10%三氯乙酸和0.65% 2-硫代巴比妥酸的匀浆在95℃加热60分钟，然后冷却至室温，并以10,000g离心10分钟。在532nm和600nm处读取上清液对空白试剂的吸光度。膜渗透性按照Lutts（1995）等人的方法，以电解质渗漏量（EL）评估。样品用DDW洗涤3次以去除表面污染物，从嫩叶上切下叶片并放入密封的含有10mL DDW的小瓶中，随后在旋转振荡器上振荡24小时，之后，测定溶液的电导率（EC1）。然后将样品在120℃下高压灭菌20分钟，并在溶液冷却至室温后再次测电导率（EC2）。电解质泄漏量定义为EC1/EC2times;100并以百分比表示。过氧化氢（H2O2）水平的测定用Velikova（2000年）等人的方法。将新鲜叶样品在5mL 0.1%（w/v）TCA中均化，匀浆以12,000rpm离心15分钟，上清液加入10mM磷酸钾缓冲液（pH7.0）和1M碘化钾中，随后在390nm下测定吸光度值。通过与使用已知浓度的H2O2绘制的标准曲线的比较来计算H2O2的含量。
2.3 抗氧化酶活性的测定
用冰冻过的研钵和研杵将500mg叶组织在提取缓冲液（100mM磷酸钾缓冲液中含0.5%Triton X-100和1%聚乙烯吡咯烷酮，pH7.0）中匀浆化制备粗酶提取物。匀浆在4℃以15,000g离心20分钟，并将上清液用于下文所述的酶促测定。过氧化物酶（POD）（EC 1.11.1.7）的活性用Chance和Maehly（1955）的方法来测定。使用5mL含有磷酸盐缓冲液（pH 6.8），50M连苯三酚，50mM H2O2和1mL稀释20倍的酶提取液的反应体系测定酶活性。将测定混合物在25℃温育5分钟，通过加入0.5mL 5%（v/v）H2SO4终止反应。用分光光度法在420nm处测定红倍酚的生成量。一个单位的POD活性定义为每毫克蛋白质每分钟形成的红倍酚的量。过氧化氢酶（CAT）（EC 1.11.1.6）的活性用Aebi（1984）的方法来测定，以240nm处吸光度的降低值来测定H2O2的分解速率。在该测定中，反应混合液为50mM磷酸盐缓冲液（pH7.8）和10mM H2O2。而超氧化物歧化酶（SOD）（EC 1.15.1.1）的活性则根据Giannopolitis和Ries（1977）的方法，基于氮蓝四唑（NBT）光还原抑制作用来测定。反应混合液（3mL）含有50mM NBT，1.3mM 核黄素，13mM甲硫氨酸，75mu;M乙二胺四乙酸（EDTA），50mM磷酸盐缓冲液（pH7.8）和20-50mL酶提取物。反应溶液在75mu;M m-2 s-1的荧光下照射15分钟，以未经照射的反应混合液调零，读取560nm处的吸光度。一个单位的SOD活性被定义为抑制50%的NBT光还原反应。
2.4 统计分析
数据表示为平均值plusmn;标准误差，并使用IBM SPSS Ver.22统计软件（IBM公司及其他，Armonk，NY，US
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