利用自猝灭和去猝灭荧光探针实时检测和监测环介导扩增(LAMP)反应外文翻译资料

 2022-08-04 02:08

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利用自猝灭和去猝灭荧光探针实时检测和监测环介导扩增(LAMP)反应

1 摘要

环介导等温扩增(LAMP)是一种新型等温核酸扩增技术，具有操作简便、灵敏高、检测速度快的优势。而且反应不需要仪器和昂贵的试剂，在一些基层机构和现场检测被广泛应用。目前，LAMP的检测方法主要为依赖浊度检测和非特异性染料等间接检测方法，这往往会导致假阳性的产生。在本研究中，我们开发了一种直接检测方法，在环状扩增区域标记荧光探针，未结合状态时熄灭，仅与目的片段结合时发出荧光因此，这项技术被称为自猝灭/去猝灭探针LAMP检测方法(FLOS-LAMP)。它可以对LAMP扩增片段进行特异性检测。FLOS-LAMP检测方法已被广泛验证。在检测人类病原体水痘带状疱疹病毒中，FLOS-LAMP的检测限为500拷贝，临床敏感性和特异性分别为96.8%和100%。该技术具有很强的特异性，解决了LAMP技术易出现假阳性的缺点。同时FLOS-LAMP与其他LAMP引物组和不同的荧光团一起使用时，也展现出它的通用性和适应性。

关键词：环介导等温扩增(LAMP)、猝灭、特异性检测、环状引物荧光

2 前言

利用聚合酶链反应(PCR)进行现场诊断(POC)诊断所面临的挑战推动了基于等温原理的核酸扩增检测的发展，这些原理通常被称为iNAATrsquo;s。这些技术包括:链位移扩增(SDA)，解旋酶依赖扩增(HDA)，重组酶聚合酶扩增(RPA)和环介导扩增(LAMP)。iNAAT与PCR相比，它的一个优点是可以在恒温条件下扩增目的片段，从而避免了两步或三步PCR所需热循环步骤。由于不进行热循环步骤，iNAAT反应非常快(5-20分钟)，因此与传统PCR相比，“样品到答案”的时间更短。由于不需要热循环，扩增反应可以使用简单的仪器进行，例如传统的水浴锅，大大降低了设备成本。这一特点使得等温扩增系统在在基层机构和现场检测有很大优势。

在iNAAT中，LAMP技术在实验室和现场诊断被广泛的应用。这种体外扩增技术在60-65°C的恒温反应条件下，将少量目标分子扩增到109-1010个拷贝。由于LAMP反应扩增时间短(10-15分钟)，扩增产率高（gt;10micro;g）。因此具有很高的灵敏度。在大多数情况下其检测灵敏度超过实时定量PCR (qPCR)—大多数分子诊断分析中最常见的“金标准”技术。LAMP反应主要由四条引物组成，即FIP(正向内引物)、BIP(反向内引物)、F3(正向引物)和B3(反向引物)识别目标序列的六个不同区域。在LAMP反应中也可加入两对环引物LF(正向环引物)和LB(反向环引物)，来提高反应速度。这个修改称为“加速LAMP”，是后来对经典的四引物LAMP的修改。LF/LB引物通过为自动循环的FIP/BIP引物创造额外的结合位点来加速四个引物的LAMP反应。这种自动循环可以形成“花椰菜式”DNA结构，这种结构本质上是DNA串联体，在交替的反向重复序列之间穿插着环状结构。

通常，LAMP检测为终点检测。它需要对扩增后的产物进行测定，所以可能导致交叉污染或非特异性扩增。常见方法包括:解决放大产品在琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，,利用浊度仪检测LAMP反应中焦磷酸镁的沉淀，在紫外光下检测dsDNA，如SYBRGreenI或EvaGreen以及添加金属离子指示剂。如钙黄绿素/ Mn 2 和HNB染料。其中，插入荧光染料被用于临床诊断，因为它们对蛋白质等不透明物质更敏感和相对耐受，而这些物质会影响浊度信号。然而，非特异性检测方法的一个主要缺点是容易产生假阳性。尽管LAMP由4-6个不同的引物独立识别靶序列上的6-8个独立区域，在理论上比PCR具有更高的特异性。虽然非特异性扩增的机制尚不清楚，但有推测认为这可能是6个引物相互作用导致的。因此，间接检测扩增产物仍然是LAMP的主要缺点之一。

能以序列依赖的方式特异性地与瞬时产生的单链DNA结构杂交的荧光标记的核酸已被证明是任何非特异性的，基于染料的检测系统的理想解决方案。这方面的例子包括专门为qPCR开发的基于水解的TaqMaTM探针和许多其他的分子信标。由于iNAAT和LAMP本身的非典型扩增化学，这些专门为qPCR开发的探针技术的无缝应用已被证明是技术上的挑战。然而，人们已经尝试开发一种基于探针的LAMP检测系统，包括:信号丢失鸟嘌呤猝灭、使用标记引物获得信号荧光、通过释放猝灭(DARQ)检测扩增、同化探针、一步抓住(OSD)报告器，以及最近的分子信标

本文献展示了使用自猝灭荧光探针作为实时检测和监测LAMP反应的替代方法。这些探针最初是作为发光延伸技术的一部分进行开发的，测试了它们对实时检测LAMP反应产物的适用性。这种新型的实时荧光LAMP技术，即自灭LAMP上的环状引物荧光(FLOS-LAMP)，可用于检测临床上重要的人类病原体水痘带状疱疹病毒(VZV)。

优选的试验目标病毒VZV是水痘和带状疱疹的病原体，无论是免疫能力强的还是免疫功能低下的个体，常导致中枢神经系统表现和肺炎。这些疱疹病毒感染并建立终身潜伏期，随后从人类感觉神经元神经节重新激活。无论是从治疗角度还是从感染控制角度来看，其快速、早期发现对有症状的患者都非常重要。由于其独特的信号发生机制，即仅在靶标存在时才产生荧光，因此所提出的LAMP方法大大提高了我们在实际临床样本中特异性检测VZV的能力。

3 方法

3.1 FLOS-LAMP探针的设计

FLOS-LAMP探针的设计方法是用荧光团标记每个LAMP引物(F3、B3、FIP、BIP、LPB和LPF)的内部胸腺嘧啶(T)残基。确定确切的T残留的荧光团可以附加有效淬火/ de-quenching以下标签criteria26, 27日使用:(1)的胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)残留在三号航站楼的结束,(2)T残留在第二或第三位置从这3 端,和(3)一个或多个G核苷酸侧翼T残渣(可选)。最初的假设检验和随后的开发/优化研究集中在单一LAMP引物组，即“VZV62”(表1)，该引物此前被设计为特异性扩增水痘带状疱疹病毒ORF62基因38。在本研究结果的基础上，开发了用于巨细胞病毒(CMV)基因UL5439(见附表S1)、单纯疱疹病毒(HSV)-1基因US440(见附表S2)和克隆载体pUC19(内部设计;参见补充表S3)。VZV62、CMV-UL54和HSV1-US4 LAMP引物使用常用荧光团荧光素(FAM)标记，pUC19 LAMP引物使用荧光团JOE(6-羧基-4 ，5 -二氯-2 ，7 -二甲氧基荧光素)分别标记。荧光团通过一个6碳的间隔臂连接在T残基上，位于环的5号位置。FLOS-LAMP探针可从IDT (Coralville, IA)或biobbasic公司(Markham, ON)定制(HPLC纯化级)。

3.2 目标DNA模板

通过IDT (Coralville, IA)的Minigene质粒(plasmid (Minigene))测序，获得了VZV62 LAMP的目标基因ORF62 gene38。将DNA质粒(pVZV-ORF62)溶解于TE缓冲液中，工作浓度为1 times; 106 copies/micro;L。以普通克隆载体pUC19为标准模板，浓度为1 times; 106拷贝/micro;L。采用gBlocktrade;(IDT)格式自定义合成了HSV1 US4 gene40的线性双链DNA片段，作为HSV1-US4 LAMP引物(1 times; 106 copies/micro;L)的靶标。

3.3 FLOS-LAMP反应条件及检测

FLOS-LAMP反应(共20micro;L)包含12micro;L的iso - 004等温大师混合(Optigene,英国霍舍姆)包含Geobacillus物种DNA聚合酶(2.0 GspSSD LF),耐热性的无机焦磷酸酶,优化缓冲区(包括MgCl2核苷酸和其他专用添加剂),3micro;L探针/探针混合物和5micro;L的DNA模板。在某些实验中，还使用了加色剂(ISO-004)，它含有一种专有的双链DNA插入染料。LAMP检测在实时荧光仪ESEQuant TS2.6 (Qiagen GmbH, Lake Constance, Germany)上进行，在制造商(Optigene)推荐的最佳时间和温度65℃下进行20分钟。对仪器进行编程，每30秒采集一次荧光信号。当任何信号达到斜率值，距基线(0 mV) gt;20 mV时，用ESEQuant TS2 studio软件ver 1.17.0 (Qiagen)软件标记为阳性扩增。时间到正(Tp)值(分钟)是将x轴刻度上的数值(指定为时间[30秒间隔])除以2得到的。

3.4 临床样本

以前通过qPCR41检测VZV阳性的临床样本(Cq lt; 40 =阳性;Cqge;40 =阴性;见补充表S4)或商业直接荧光测定(DFA;SimFluor;光诊断trade;;用EMD Millipore)验证优化后的VZV62 FLOS-LAMP扩增性能。这些在minus;80°C保存的回顾性残留样品之前提交给BC儿童医院微生物与病毒学实验室。这些样品保存在原始的通用传输介质(UTM;科潘诊断公司(Copan Diagnostics, Murrieta, CA)。为了保持患者的匿名性，每个样本都进行了编码，并删除了所有的患者标识符，以确保参与本研究的人员不知道任何患者信息。由于该研究仅涉及二次使用匿名人体生物材料，因此免除了英属哥伦比亚大学研究伦理委员会的审查。使用InstaGenetrade;基质(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)提取DNA如下:等体积的样品(50micro;L)和InstaGenetrade;基质(50micro;L)短暂涡流，并在95°C加热10分钟。5micro;L的提取液直接用于LAMP。非目标微生物包括临床标本(n = 32)，对HSV-1和-2、巨细胞病毒、eb病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、百日咳杆菌和肺炎支原体检测呈阳性(表5)。样本类型不同，包括鼻咽(NP)/口咽(OP)拭子、支气管肺泡灌洗液(BAL)、尿液、唾液和鼻腔清洗。两种商业标准，纯化的人类基因组DNA和CMV WHO标准，也被纳入非靶面板(见补充表S5)。18例既往经qPCR检测VZV阴性的临床样本也采用VZV62 FLOS-LAMP法检测。

3.5 检测灵敏度分析

将标准pVZV-ORF62质粒(1 times; 106 copies/micro;L)在TE缓冲液中连续稀释10倍，VZV62 flos lamp用5micro;L进行检测，以确定检测限。染料基础的检测也并行进行，使用同一mastermix的插层染料版本(ISO-004)，用于VZV62 flosLAMP。对VZV62 FLOS和插层染料检测方法进行三次检测。

4 结果

4.1 FLOS-LAMP探针的设计

在每个定义的三个功能类别目前six-primerLAMP,即外部、内部和循环,我们可以确定至少一个候选引物标签(表1)。具体来说,外探针类别中的VZV62F3探针被确认,VZV62BIP, VZV62FIP和VZV62LPB内在和循环中标识类别,分别从内部引物(表1)。类别,只有VZV62FIP探针提交标签。

4.2 pVZV-ORF62试验模板的等温扩增

用 fam 标记的 vzv62f3引物扩增 pvzv-orf62质粒(1106拷贝/l) ，未检测到信号(图1a)。无论是探针(0.1 m ー0.3 m)还是无标记引物(vzv62f3/vzv62b3/vzv62fip/vzv62bip/vzv62bpf)的浓度变化都没有改变这一阴性结果。而当VZV62FIP-FAM探针(0.2micro;M)与相同的质粒模板(pVZV-ORF62: 1 times; 106 copies/micro;L)使用时，得到阳性扩增曲线(Tp = 9.5 min)(图1A)。该探针/引物组合的水控没有导致任何高于基线的荧光(信号lt;0 mV)，说明观察到的阳性信号是由于VZV62FIP-FAM探针掺入了反应产物。对于使用的VZV62FIP-FAM探针的浓度(0.2micro;M)，放大信号的最大强度在200至250 mV之间变化(图1A)。将VZV62FIP-FAM探针的浓度增加到0.3micro;M和操作其他未标记的引物，都不会改变Tp(变化9-9.5 min)或荧光信号的振幅(200 - 250 mV)。有趣的是，当使用标记的VZV62LPB-FAM(0.2micro;M)探针时，在相似的模板输入条件(pVZV-ORF62: 1 times; 106 copies/micro;L)下，信号幅值比VZV62FIP-FAM探针(200 ~ 250 mV)高出4倍(1000 ~ 1100 mV)。由于VZV62LPB-FAM获得的信号幅值较高，因此对该探针进行了进一步的优化。

(A)将外部(VZV62F3)、内部(VZV62FIP)和环路(VZV62LPB)引物转化为dT-FAM荧光探针后得到的信号谱图。输入模板浓度pVZV-ORF62质粒:1 times; 106 copies/micro;L。(B)荧光信号强度因基料水平的变化而变化，范围为0.5X、1.0X、1.5X、2.0X和2.5X。输入模板浓度pVZV-ORF62质粒:1 times; 106 copies/micro;L。以水为阴性对照。每次[30秒间隔]单元(x轴)在等温仪器上代表30秒。

4.3 基本混合料

Vzv62lpb-fam 探针(0.2 m)所用的无标记引物的浓度用“混合碱”(表2)确定。这个引物浓度范围是由生产厂家(optigene)为基于染料的 iso-00

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