工程菌Halomonas hydrothermalis Y2在低盐度的培养基中高产 四氢嘧啶外文翻译资料

 2022-08-06 11:08

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工程菌Halomonas hydrothermalis Y2在低盐度的培养基中高产

四氢嘧啶

赵琦1，李山南1，吕佩文1，孙思勉1，马翠青1，徐平1，苏海军2*和杨春雨1*

摘要

背景：作为较好的相容性溶质，1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸（ectoine）在各个领域都显示出巨大的潜力。但是，较低的生产率和高盐度介质严重阻碍了其广泛应用。

结果：产四氢嘧啶的菌株Halomonas hydrothermalis Y2的基因组中确定了整个四氢嘧啶的代谢，包括其合成和分解代谢的途径。通过框内删除负责四氢嘧啶分解代谢的编码四氢嘧啶羟化酶（EctD）和（或）四氢嘧啶水解酶（DoeA）的基因，破坏了四氢嘧啶的利用途径并明显提高了生产率。使用在500 mL烧瓶中含有100 g L-1 NaCl的优化培养基，Y2 /Delta;ectD/Delta;doeA的双突变体在培养30 h后合成了3.13 g L-1 四氢嘧啶。这比野生型菌株（1.91 g L-1）高得多，并且还超过了Y2 /Delta;ectD（2.21 g L-1）的产量。Y2/Delta;ectD/Delta;doeA显着增强了四氢嘧啶的蓄积，这表明Doe途径在四氢嘧啶分解代谢中起着至关重要的作用。此外，为了降低发酵培养基的盐度并克服废水处理的困难，基于菌株Y2/Delta;ectD/Delta;doeA构建了缺少关键Na /H 反向转运蛋白（Mrp）和（或）NhaD2的突变体。结果，Mrp缺陷型菌株可以在含有较低浓度NaCl的培养基中合成等量的四氢嘧啶（约7 g L-1或500 mg（g DCW）-1）。在60 g L-1 NaCl胁迫的分批补料发酵过程中，Mrp缺陷型菌株最多可积累10.5 g L-1四氢嘧啶，比产量为765 mg（g DCW）-1，谷氨酸钠产量为0.21 g g-1。

结论：Y2 /Delta;ectD/Delta;doeA显着提高了四氢嘧啶的产量，这暗示了Doe途径在四氢嘧啶分解代谢中的关键作用。而且，Mrp缺陷型菌株降低的盐度需求暗示了许多相容性溶质生物合成的可行方案，即通过嗜盐菌中的一些Na /H 反转运蛋白，从而来降低培养基盐度。

关键词：四氢嘧啶合成 Doe途径 Na /H 反向转运蛋白 Mrp反向转运蛋白 盐度降低培养基

  1. 背景

技术Ectoine（1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸）是一种环状氨基酸衍生物，在某些嗜盐和耐盐微生物中是相容性最广的溶质之一，并且在嗜盐甲烷营养菌和甲基营养菌中也是主要的相容性溶质[1-4]。除了具有保护细胞免受高渗透压的主要功能外，对生物大分子（酶，DNA，抗体，甚至整个细胞）有很好的稳定特性，在皮肤护理、食品加工、分子生物学、农业、生物技术以及人类疾病等领域具有极高的潜力和医学价值[5-11]。

四氢嘧啶可由大量的好氧、异养细菌合成，例如嗜盐螺菌属、盐单胞菌属、嗜盐杆菌、弧菌属、gamma;-变形杆菌类假单胞菌，甚至古生菌亚硝化菌或甲基嗜碱菌[12-15]。在商业上，它是由中等中度嗜盐细菌长盐单胞菌生产的，该菌具有建立的四氢嘧啶代谢生物合成途径。从前体L-天门冬氨酸-beta;-半醛（ASA）出发，通过二氨基丁酸转氨酶（EctB），二氨基丁酸乙酰基转移酶（EctA）和四氢合酶（EctC）的催化组合来合成ectoine。在一定的压力条件下（例如高温），已证明部分四氢嘧啶可被四氢嘧啶羟化酶（EctD）转化为5-羟基四氢嘧啶[18,19]。

在微生物中，四氢嘧啶和5-羟基四氢嘧啶不仅作为优异的应激保护剂而积累，而且还可以作为细胞生长有价值的营养物质。在菌株中华根瘤菌，梨核菌DSS-3和长双歧杆菌DSM 2581T中也发现了类似的涉及四氢嘧啶分解代谢的基因簇。在长双歧杆菌DSM 2581T中，该基因簇由doeA（水合水解酶），doeB（Na-乙酰基-1,2,4-二氨基丁酸脱乙酰基酶），doeC（天冬氨酸-半醛脱氢酶）和doeD（二氨基丁酸转氨酶）组成，已通过基因缺失验证。最近，在红曲霉菌DSS-3中鉴定了更详细的分解代谢途径及其调控系统。这些遗传回路为遗传控制四氢嘧啶积累提供了途径，对于四氢嘧啶生产很有价值。

由于相容性溶质的积累需要高渗透压，因此通常使用高盐度的发酵培养基进行富集，对发酵罐的防锈和废水处理提出了很大的挑战[20]。因此，低盐度的培养基对于大规模的四氢嘧啶生产以及某些其他相容性溶质是理想的[21]。从纸浆厂废水的人工碱性环境中分离出H.hydrothermalis Y2。作为嗜盐菌的极端嗜热菌，该菌株在0至180 g L-1 NaCl的广泛盐度下生长良好。正如我们先前所观察到的，四个Na /H 反转运蛋白在处理盐和碱性环境时以分工的方式工作，其中NhaD2和Mrp在pH和渗透平衡中起着重要的生理作用。 在本研究中，基于缺少doeA和ectD基因的双突变体，将Mrp和（或）NhaD2进行了框内删除，并研究了它们对四氢嘧啶生产率的影响。

  1. 结果

嗜热链球菌Y2中预测的四氢嘧啶代谢途径

正如在伸长双歧杆菌DSM 2581 T和需盐色盐杆菌的基因组中观察到的，位于嗜热链球菌Y2（NCBI编号：CP023656）的染色体中的两个基因簇可能参与了四氢嘧啶的合成和分解代谢（图1）。用于生物合成途径的酶，即EctA（Orf02990），EctB（Orf02889）和EctC（Orf02888）聚集在一起。另外，基因组中也存在负责5-羟基四氢嘧啶合成的编码四氢嘧啶羟化酶（EctD）的基因（Orf00558），但距离较远。四氢嘧啶降解的途径位于另一个簇中，该簇由六个Orf组成，范围从Orf00344到Orf00349，分别编码DoeA，DoeB，DoeX，DoeC和DoeD酶。这些酶表现出与长双歧杆菌DSM2581T蛋白质同源性gt;80%。

图1. H.hydrothermalis Y2菌株果胶代谢途径的预测基因簇。 ectA：1-2，4-二氨基丁酸Ngamma;-乙酰基转移酶基因（编号ATH78870.1）； ectB：1-2，4-二氨基丁酸转氨酶基因（编号ATH78869.1）； ectC：外泌素合酶基因（编号ATH78868.1）； ectD：ectoine羟化酶基因（编号ATH76535.1）； doeA：油桃水解酶基因（编号ATH76416.1）； doeB：Na-乙酰基-1，2，4-二氨基丁酸脱乙酰基酶基因（编号ATH76415.1）； doeX：转录调节子（编号ATH76414.1）； doeC：天冬氨酸-半醛脱氢酶基因（编号ATH76412.1）； doeD：1-2，4-二氨基丁酸转氨酶基因（编号TH76411.1）； teaA：结合外泌素的周质蛋白基因（编号ATH77233.1）； teaB：油桃TRAP转运蛋白小通透酶基因（编号ATH77234.1）； teaC：植物素TRAP转运蛋白大通透酶基因（编号ATH77235.1）； teaD：TRAP-T相关的普遍应激蛋白编码基因（编号ATH77236.1）

如长双歧杆菌DSM2581T的四氢嘧啶模型中所描述的，这些酶形成了四氢嘧啶产生和降解的代谢循环。与e.atalong DSM2581T相比，在d酸的ORF（Orf00346）。通用UniProt和NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据中的序列分析表明，这种推定蛋白可能是双鸟苷酸环化酶（GGDEF）结构域，参与c-di-GMP二级信号的重要合成蛋白。根据NCBI中的序列比对，我们搜索了报道的Halomonas物种的基因组，发现只有少数盐单胞菌株在Doe途径中拥有该蛋白。需要进行进一步的详细研究对于这种假定的蛋白在四氢嘧啶代谢中的功能。

Doe途径破坏性菌株产生的ectoine

在预测的嗜水嗜热菌Y2途径中，如在长链球菌DSM2581T中观察到的那样，四氢嘧啶可以用作合成羟基四氢嘧啶的底物或者细胞营养物质 。为了阻止这些四氢嘧啶的消耗并获得更多的四氢嘧啶积累，我们在Y2的基因组中敲除了ectD和（或）doeA的基因，从而构建了一个单突变体Y2/Delta;ectD和Y2/Delta;ectD/Delta;doeA的双变异体。通过使用修改过的MG培养基（修改后用34 g L-1的谷氨酸钠（MSG）和100 g L-1的NaCl组成的谷氨酸钠培养基（MMG培养基，pH 9.0），比较了嗜热热菌Y2和两个突变体在500 mL摇瓶中的生长以及四氢嘧啶的产量。值得一提的是，高碱度导致MMG介质中出现一定量的沉淀。如图2a所示，除了在这种产生菌素的培养基中含量较多的谷氨酸钠和氯化钠外，还检测到相对较高的细胞干重（CDW）值，包括本研究中的所有其他发酵批次。可以预期，随着菌株的生长，这三株菌株的四氢嘧啶产量逐渐增加（图2b），Y2在18h的最大四氢嘧啶产量为1.91 g L-1，而最大生产率为2.21和3.13 g L-1分别由突变体Y2 /Delta;etcD和Y2 /Delta;etcD/Delta;doeA培养24和30小时后获得。如图2a所示，野生型菌株Y2和Y2 /Delta;ectD在培养30小时后均产生了第二个生长，并同时消耗了合成的四氢嘧啶（图2b）。培养48小时后，野生型菌株Y2降解了总共50%的四氢嘧啶。与菌株Y2相比，两个突变体消耗更少的四氢嘧啶，尤其是菌株Y2/Delta;etcD/Delta;doeA（降解20%）。我们怀疑这两个分解代谢途径的缺乏导致了达到最大生物量后四氢嘧啶的量持续增加，从而使四氢嘧啶的积累呈现出比菌株Y2更长的曲线。结果，与野生型菌株相比，该双突变体Y2/Delta;ectD/Delta;doeA可以再合成63.8%的四氢嘧啶，该双突变体的消耗率低于其他两个菌株。这表明四氢嘧啶降解途径，特别是Doe途径的破坏，极大地促进了该菌株中外源积累。但是，值得注意的是，在双突变体发酵的后期，仍约消耗了20%的菌素。这表明Y2菌株的基因组中可能还存在其他未知的降解途径，并利用吗啡作为碳源或氮源。

图2.在500 mL装有100 g L-1 NaCl pH值为9.0的500 mL烧瓶中，嗜热链球菌Y2，Y2 /Delta;etcD和Y2 /Delta;etcD/Delta;doeA的生长和产生。 细胞干重（CDW）。 b总果胶滴度（g L-1）。 每个实验重复三次。

图3在不同的NaCl浓度下，嗜水热菌Y2及其突变体的生长（a）和植物素生成（b）。 线代表总外泌素滴度（g L-1），列代表总外泌素比生产[mg（g CDW）-1]。 将菌株在含有各种NaCl的pH值为9.0的500 mL烧瓶中培养。 每个实验重复三次。

NaCl胁迫下Na /H 反转运蛋白缺陷菌株产生的四氢嘧啶

为了减轻菌株四氢嘧啶合成培养基中的盐度，删除了突变体Y2/Delta;ectD/Delta;doeA中的两个主要Na /H 反转运蛋白，并测试了它们在500 mL摇瓶中的四氢嘧啶累积能力。培养24小时后，突变体Y2/Delta;ectD/Delta;doeA在20–60 g L-1 NaCl范围内获得最大生长量，然后逐渐被盐度升高所抑制（图3a）。可以预料，高盐分胁迫对四氢嘧啶积累至关重要，在100 g L-1 NaCl胁迫下检测到最高的生产力（图3b）。缺少NhaD2反转运蛋白比Y2/Delta;ectD/Delta;doeA略微降低了细胞的生长，而在低盐度（lt;80 g L-1）下，四氢嘧啶合成显示出相似的特征，在含有100g L-1 NaCl的培养基中也出现了到最大含量。与此不同，Mrp反转运蛋白的缺失极大地影响了高盐度下的菌株生长，因此导致较高的比值。如图3a所示，高NaCl胁迫明显抑制了缺乏mrp的菌株的生长，尤其是在NaCl含量高于100 g L-1的培养基中。尽管生长受阻，但mrp缺乏导致在较低盐度下显着增强了四氢嘧啶的合成（图3b），在含有80 g L-1 NaCl的培养基中观察到最大量。在含有80 g L-1 NaCl的培养基中补充后，Y2/Delta;ectD/Delta;doeA/Delta;mrp的四氢嘧啶产量（2.93 g L-1）等于或略高于累积在含有100 g L-1 NaCl成分的培养基中的菌株Y2/Delta;ectD/Delta;doeA的最大产量（2.86 g L-1）。在较高的盐胁迫下，Mrp的缺乏严重影响了细胞的生长，四氢嘧啶产量急剧下降。但是，突变的细胞对高盐环境（120 g L-1 NaCl）更敏感，并且同时合成了更多的四氢嘧啶来保护细胞。结果是，缺少Mrp反转运蛋白的突变体观察到特异性的四氢嘧啶产生量显着增加（图3b）。

分批发酵

通过保持相同的接种量和培养条件，在相同控制的1-L生物反应器中，进一步比较了Y2，Y2/Delta;ectD/Delta;doeA和Y2/Delta;ectD/Delta;doeA/Delta;mrp的四氢嘧啶生产能力。在48小时的培养过程中，这三种菌株在第一个培养阶段均表现出相似的生长特征（图4a），在24小时的孵育后达到稳定期，并在30小时后均表现出二次生长。与它的突变体相比，菌株Y2在二次生生长中生长旺盛，并且相应地观察到了显着降低的四氢嘧啶含量。如图4a所示，在36-48小时的培养期间，生物量（CDW）从16.6增加到21.7 g L-1。在此期间，总四氢嘧啶产量从5.5降至2.0 g L-1，相应的四氢嘧啶消耗率为0.191。但是，两个突变体的四氢嘧啶含量降低很小，在突变体Y2/Delta;ectD/Delta;doeA中从7.2降低到6.7 g L-1，在Y2/Delta;ectD/Delta;doeA/Delta;mrp中从7.2降低到6.5 g L-1（图4b，c）。因此，此阶段的四氢嘧啶消耗速率远低于野生型菌株（分别为0.037和0.057），并且这两个突变体的次级生长都比野生型菌株弱。Y2/Delta;ectD

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