重组大肠杆菌中主要的壶腹酸蜘蛛丝蛋白2（MaSp2）合成的代谢工程外文翻译资料

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重组大肠杆菌中主要的壶腹酸蜘蛛丝蛋白2（MaSp2）合成的代谢工程

作者：郝曹、沙法克·帕维恩、丁定、徐海军、田伟坦amp;罗柳

摘要：在本研究中，利用代谢工程技术在工程大肠杆菌中合成了主要的壶状大肠杆菌蜘蛛丝蛋白2（MaSp2）。一个反复无缝拼接的策略被用来组装MaSp2基因，可达10000个碱基对，预计100kDa蛋白以上。然而，只获得了55kDa重组的MaSp2。由于MaSp2富含丙氨酸和甘氨酸残基，因此在蛋白质翻译过程中采用了甘氨酰/丙氨酸-tRNA库和额外的氨基酸添加来补充丙氨酸和甘氨酸。在培养基中加入补充的丙氨酸和甘氨酸（0.05wt%），及在pET28a（ ）中构建的MaSp2和pET22b（ ）中构建的甘氨酰/丙氨酸-tRNA在大肠杆菌BL21（DE3）中共同表达。结果在目前工作中得到了分子量为110kDa的人工MaSp2。这项工作展示了一个应用代谢工程方法的成功例子，并为增强的甘氨酰/丙氨酸-tRNA库在工程大肠杆菌中实现具有重复基序的高分子量蛋白的表达提供了一种可能的途径。

正文：

蜘蛛丝是一种具有独特力学性能的生物材料。蜘蛛丝具有优异的强度、韧性、弹性，比钢强5倍，比同等重量的凯夫拉纤维强3倍。此外，蜘蛛丝具有良好的生物相容性和生物降解性，是一种很好的医用材料。蜘蛛丝在军事上可用于制作降落伞绳、电缆滑车和防弹衣，用于制作伤口缝合线、药物输送容器和医用组织支架。

到目前为止，由于所需的力学性质和已知的蛋白质序列，主要的壶状蜘蛛丝蛋白（MaSp）比其他的蜘蛛丝蛋白引起了更多的关注。MaSp序列是高度模块化的长重复序列，包括聚丙氨酸（An）、聚甘氨酸/丙氨酸（（GA）n）、GPGXX（X=G、Q、Y、A、S）和GGX（X=L、Y、S、A）。MaSp包括两种主要蛋白质：主要壶腹状蜘蛛丝蛋白1（MaSp1）和主要壶腹状蜘蛛丝蛋白2（MaSp2）。MaSp1和MaSp2的差异在于脯氨酸的序列和聚合模式。MaSp1含有少量脯氨酸残基（lt;1%），具有很高的强度，而MaSp2是一种富含脯氨酸的蛋白质（~9%），具有很高的弹性，因为MaSp2的特征氨基酸序列是GPGXX，它形成beta;-转角螺旋结构，增强了牵引纤维的弹性。

不幸的是，蜘蛛是一种领土性和侵略性的生物。因此，通过养殖蜘蛛状家蚕来生产蜘蛛球蛋白是很困难的。因此，一些研究者开始关注利用代谢工程策略合成蜘蛛丝蛋白纤维。然而，从生物合成的角度来看，高效生产具有重复序列的高分子量蜘蛛丝蛋白是困难的。大多数异源表达系统由于多种原因受到低表达水平的困扰，包括克隆的不稳定性、翻译暂停和氨基酸和/或tRNA库的耗尽。作为一个成功的例子，在2010年，夏等人。表达了284.9kda的重组斑蛛MaSp1，并纺入纤维中，力学性能有所提高，但与天然丝纤维相比，人工斑蛛MaSp1的弹性仍然不足。MaSp的弹性依赖于中间富含甘氨酸的重复序列，如MaSp1的GGX基序和MaSp2的GPGXX基序。Liu等人。证明含有GPGXX基序的脯氨酸比MaSp1具有更好的弹性。以及Rauscher等人。还确定脯氨酸是MaSp类弹性蛋白性质的主要决定因素。

利用基因工程和重组DNA技术，从黑腹滨藜、几何学滨藜、马达加斯加软骨病、塞内加尔软骨病和枝状软骨病蜘蛛中获得了多个MaSp2基因编码。Santos Pinto等人。用269kDa从尼菲拉斑蛛的原生大壶腹丝中分离纯化出MaSp2。然而，很少有研究报道重组MaSp2在异种宿主中的表达。在本研究中，我们组装了斑蛛的串联重复MaSp2基因，并通过添加适当的氨基酸和增强的tRNA库，在代谢工程大肠杆菌中表达了高达110kda的重组MaSp2。110kDa的MaSp2产品显示出在纤维中纺丝的潜力，这将在未来的分析中进行表征。此外，外源表达可为蜘蛛丝蛋白的工业化生产铺平道路。

结果与讨论

设计并组装MaSp2基因。为了构建具有重复基因片段的大尺寸基因，通过添加相容但不可再生的侧翼限制性内切酶位点，发展了反复无缝拼接策略。该策略可以支持目标序列的从头到尾组装，并允许以任何所需比率混合任何DNA盒/模块。通过对不同DNA序列的识别，可以产生保守的粘端。由于MaSp2的DNA序列是由串联重复序列组成的，侧翼序列的作用很小。MaSp2的单体序列设计如下：NdeI和BfaI加下划线。斜体的EcoRI和XhoI用于克隆和组装。

CTCGGAATTCTCATATGGTCCTGGCCAACAAGGTCCATCTGGTCCTGGCTCTGCAGCTGCAGCAGCTGCTGCAGCTGGTCCAGGTGGCTATGGTCCTGGCCAGCAAGGTCCAGGTGGCTAGTAACGACTCTCGAGTCGG

BfaI可以识别一个特定的序列CTAG，Ndei可以识别一个特定的序列CATATG，但它们都可以产生相同的粘性末端TA。连接后的序列为CTATG，它是编码序列（GGC-TAT-GGT）的一部分，不能被限制性内切酶消化。此外，GGC TAT GGT序列编码Gly-Tyr-Gly肽链，这是MaSp2的基本肽单元。

采用相同的策略，构建了2、4、8、16、32、64、96等不同串联自旋的MaSp2基因片段。该基因的大部分串联时间可达96转（图1）。

蛋白质表达和产品验证。如图2所示，pET28alpha;-SPIL8和PET28alpha;-SPIL16的重组MASP2S表达，分子量分别约为25 kDa和55 kDa。相反，在pET28a-Spin32、pET28a-Spin64和pET28a-Spin96中的重组MaSp2s不能表达。此外，尽管测量误差和额外的氨基酸组成（如His标记）可能会影响测量百分比的结果（表1），但带有Spin8的MaSp2和带有Spin16的MaSp2的氨基酸组成均接近理论百分比。

培养基中补充氨基酸对MaSp2表达的影响。为了研究补充氨基酸对MaSp2表达的影响，在培养基中加入不同量的丙氨酸和甘氨酸（0.05 wt%，0.1 wt%，0.2 wt%，0.3 wt%，0.4 wt%，0.5 wt%），然后用Spin16检测MaSp2的表达。含有Spin16的MaSp2s可以在所有测试量的补充氨基酸中表达（图3）。如图4所示，当氨基酸添加量为0.05 wt%时，MaSp2的表达量达到最高值（22.09%），但随着丙氨酸和甘氨酸添加量的增加，MaSp2的表达量略有下降。添加0.05wt%的氨基酸能促进细胞生长，但过量的丙氨酸和甘氨酸（大于0.2wt%）对细胞生长有明显的抑制作用。然而，在添加0.05 wt%丙氨酸和甘氨酸的情况下，在与MaSp2和Spin16相同的表达条件下，MaSp2和Spin32仍然不能表达。

高分子量外源蛋白在宿主体内不易表达。此外，作为重复的氨基酸序列，MaSp2的翻译过程可能需要足够的tRNAs和氨基酸。在目前的工作中，直接添加氨基酸并没有达到预期的效果。可能的原因是在翻译过程中，细胞系统需要tRNA来运输特定的氨基酸来表达目的蛋白，而大肠杆菌不能提供足够的糖基和丙氨酸tRNA来表达具有高分子量和Gly-Ala重复序列的MaSp2。为了给蛋白质翻译提供额外的tRNA，pET22b-glyVXY-alaT*2（含糖基/丙氨酸tRNA的编码）被转化到大肠杆菌中以增加一定的tRNA池（图5）。此外，按照先前的策略，将pET28a-Spin32和pET22b-glyVXY-alaT*2同时转移到大肠杆菌中，与Spin32共同表达MaSp2。结果，在大肠杆菌中成功表达了含有Spin32（110kda）的MaSp2，增强了甘氨酸/丙氨酸tRNA池，并添加了0.05wt%的丙氨酸和甘氨酸（图6）。经纯化、冻干后，含Spin32的MaSp2的表达量为150mg/L；含Spin32的MaSp2的氨基酸组成如表1所示。

代谢工程已被广泛应用于表达目的蛋白，以克服宿主的局限性。然而，一些特殊蛋白（如高分子量蛋白）的表达仍然是异质宿主面临的挑战。蜘蛛丝蛋白作为一种高分子量蛋白质，具有重复的Gly和Ala氨基酸序列。在代谢工程的现阶段，蜘蛛丝蛋白的生产面临的主要技术挑战是大基因的构建和高分子量蛋白的表达。本文利用大肠杆菌代谢工程技术，从棒状芽胞杆菌中制备了高达110kda的重组蜘蛛丝蛋白MaSp2。以前只在哺乳动物细胞中观察到来自枝状芽胞杆菌（110kda）的MaSp2的相似大小。以大肠杆菌为表达宿主的生产效率更高。在今后的工作中，将分析人工MaSp2的力学性能。另一方面，将从异质宿主和质粒的角度进一步研究带有Spin64和Spin96的MaSp2的表达。

图1。不同串联自旋的重组MaSp2基因的核酸电泳。MaSp2基因具有自旋（A）、自旋2（B）、自旋4（C）、自旋8（D）、自旋16（E）、自旋32（F）、自旋64（G）和自旋96（H）。每一个凝胶（A-H）与全长制造商车道是从不同的凝胶裁剪。原始凝胶如补充图1所示。

图2。重组MaSp2的SDS-PAGE分析。车道（M）：全长标记；车道（1）：空矢量。车道（2）：MaSp2和Spin32。车道（3）：MaSp2和Spin16。车道（4）：带有Spin8的MaSp2。靶蛋白通过盒被突出显示。

表1。不同旋度MaSp2的氨基酸组成分析。

图3。SDS-PAGE分析Spin16蛋白在不同氨基酸含量下的表达。Lane（M）：全长标记；车道（1）：不供应氨基酸；L车道-7）：分别供应0.05 wt%、0.1 wt%、0.2 wt%、0.3 wt%、0.4 wt%、0.5 wt%丙氨酸和甘氨酸。靶蛋白以盒为单位突出显示。

图4。补充氨基酸对细胞生长和蛋白质表达的影响。数据显示为平均值plusmn;标准偏差（n=3）。

此外，相关的tRNA补充表达策略，可以丰富细胞内相关的氨基酰tRNA以合成新生蛋白，应用于过量氨基酸组成的蛋白表达。

方法

菌株、质粒和化学物质。E、 大肠杆菌W3110菌株保存于本实验室，用于基因组DNA的分离。E、 大肠杆菌BL21（DE3）和Top10分别来自中国天根公司，用于蛋白表达或质粒扩增。表达载体pET28a 、pET22b ，购自德国Novagen。

所有限制性内切酶、焦贝斯特DNA聚合酶均购自Takara，T4 DNA连接酶购自新英格兰生物实验室（美国）。质粒制备试剂盒、PCR纯化试剂盒和凝胶提取试剂盒

图5。增强tRNA库的新生蛋白质合成示意图。

图6。用Spin32对MaSp2进行SDS-PAGE分析。车道（M）：全长标志。车道（1）：MaSp2和Spin32在增强型tRNA系统中。车道（2）：MaSp2，控制系统中有Spin32。车道（3）：空向量。目标蛋白通过盒被突出显示。

从Omega bio-tek（美国）购买。聚合酶链反应（PCR）寡核苷酸引物由中国生物医药股份有限公司合成。

质粒构建。由于蜘蛛蛋白分子量大，含有重复的氨基酸序列，采用从头到尾的策略构建了含有重复寡核苷酸的质粒。Nephila clavipe的MaSp2序列来自NCBI（GenBank登录号P46804）。单体基因自旋的合成采用重叠PCR法，所用引物见表2。用EcoRI和XhoI酶切PCR产物单体，克隆到pET28a 。为了构建具有多个重复序列的大编码单元，测序后的单体自旋采用“从头到尾”的策略，使用两个相容但不可再生的限制性内切酶位点（NdeI和BfaI），即异考达默尔。用EcoRI和XhoI消化含单体的质粒，释放插入的基因。插入物被分成相等的部分

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