代谢组学结合通路分析表征BED-3诱导的小鼠生殖毒性反应的代谢变化外文翻译资料

 2022-08-08 03:08

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代谢组学结合通路分析表征BED-3诱导的小鼠生殖毒性反应的代谢变化

摘要

多溴联苯醚(PBDEs)可能影响雄性生殖功能。 四溴二苯醚(BDE-3)是溴化程度较高的多溴二苯醚的光降解产物，是环境中最基本的一溴二苯醚，但研究较少。 本研究的目的是研究BDE-3诱导的生殖毒性，并通过代谢组学方法探讨其机制。 在本研究中，，将BDE-3分别以0.0015、1.5、10和30mg/kg的剂量对小鼠进行连续六周的灌胃给药，通过精子分析和组织病理学考察评价其生殖毒性。 应用UPLC- Q-TOF/MS对对照组和BDE-3处理组小鼠的睾丸组织、尿液和血清样本的代谢物进行分析。 结果表明，BDE-3处理后精子数量呈剂量依赖性下降，异常精子百分比增加。 组织病理学观察也显示BDE-3处理的小鼠曲细精管和附睾的变化。代谢组学分析表明，不同的BDE-3组表现出了不同程度上的代谢紊乱。 我们在睾丸组织、尿液和血清中分别鉴定出了76、38和31种不同的代谢物。 通路分析揭示了包括酪氨酸代谢，嘌呤代谢和Ribofavin代谢的几种代谢通路，这可能为BDE-3的毒性机制提供一个可能的解释。本研究表明基于UHPLC-Q-TOFMS的代谢组学方法可以更好的动态了解多溴联苯醚诱导的毒性。

多溴联苯醚(PBDEs)是一类已成为主要环境污染物的溴化阻燃剂。 2009年，多溴联苯醚被联合国环境规划署（环境署)确定为一类新的持久性有机污染物）1. 较高的溴化二苯醚可以在环境中降解为溴化物较少的多溴二苯醚， 在空气中的所有多溴二苯醚中，单溴二苯醚的光解寿命最长2. 4-溴二苯醚(BDE-3)是环境中最基本的单溴二苯醚，也是溴化程度较高的多溴二苯醚最丰富的光降解产物3–6。 BDE-3可以通过多溴二苯醚的生物转化在鱼中生成和积累7.多溴联苯醚的健康风险最近引起了全球关注。 多溴联苯醚可能干扰内分泌系统，具有神经发育毒性、致畸性和潜在致癌性8,9。 多溴联苯醚会影响男性生殖功能，人血清中多溴联苯醚的暴露水平与精子活力和浓度呈负相关10,11。 暴露于2,2lsquo;，4,4rsquo;-四溴二苯醚(BDE-47)可降低小鼠和大鼠精子获能率，改变精子活力参数，增加生殖细胞丢失和凋亡12,13. 以往的研究表明，溴化程度较低的多溴二苯醚具有更强的挥发性和生物累积性8,9 因此可能对人类健康更有害14. 单溴二苯醚可诱导哺乳动物细胞的遗传重组15。 我们以前对C. elegans 的研究还表明，BDE-3可以通过诱导ROS和DNA损伤而导致生殖功能障碍和生殖细胞凋亡16. 然而，到目前为止，对啮齿动物的单溴二苯醚毒性的研究还很少17.代谢组学方法通过利用尖端的分析平台对生物样品的代谢物含量进行全面的表征。液相色谱-质谱技术是近年来代谢组学研究中最常用的分析技术。

目前，非靶向代谢组学作为一种分析内源性代谢产物的方法以其高灵敏度、高通量和无偏性等特点已受到广泛关注。 因此，代谢组学技术逐渐应用于评价和监测药物甚至大气污染物毒性等多个方面18. 分析还显示出其在检测持久性有机污染物对健康的影响方面的巨大潜力，例如基于代谢组学的分析揭示了血浆对二恶英相关的饮食污染物暴露的反应19，确定了变化的代谢物作为多氯联苯(PCBs)和2,3,7,8-四氯二苯并对二恶英(TCDD)的潜在肝毒性的生物标志物)20，确定了多氯联苯的毒性并解释了肥胖代谢紊乱的机制21，揭示了复杂农药混合物暴露的机理22 会增加氧化应激并干扰能量代谢。

在本研究中，我们研究了BDE-3对小鼠生殖功能的影响，最低剂量为0.0015毫克/千克/天，相当于人类多溴二苯醚的最高摄入浓度(141纳克/千克/天），1.5毫克/千克/天，与BDE-47同源物的最低有效剂量相当17，中剂量10毫克/千克/天和高剂量30毫克/千克/天。 然后，我们用UPLC-Q-TOF/MS对BDE-3处理后的睾丸、尿液和血清样本进行了代谢组学分析。 用PLS-DA和单因素分析对对照组小鼠和BDE-3处理组小鼠进行模式识别来鉴定差异代谢物。 我们的结果可能为更好地理解PBDEs诱导生殖毒性的机制提供更多的证据。

结果

图1。 (A)用不同浓度的BDE-3处理的小鼠精子活力的百分比，平均plusmn;SD

（不=6）。 (B)用不同浓度的BDE-3(平均plusmn;SD)处理的小鼠精子数量(n=6)。 *plt;0.05对溶剂组，*plt;0.01对溶剂组。 (C)用不同浓度的BDE-3，平均plusmn;SD(n=6)处理的小鼠尾折精子的百分比)。

体，组织重量及临床观察。

实验期间，动物每周称重一次，在动物的体重或临床观察中没有观察到明显性差异(图1。表S1和表S1)。 解剖当天测量每只动物的睾丸和附睾重量。 在BDE-3处理6周后，溶剂组和BDE-3组的睾丸重量或附睾重量没有统计差异(图1。 S2)。

精子数量，活力和形态。

BDE-3处理组的小鼠精子活力与空白对照组相比没有变化(图1。 1a). 然而，由于BDE-3的处理，精子数量呈剂量依赖性下降(图1。 1b). 在1.5、10和30毫克/千克剂量组中，精子的平均计数分别为3.2、2.7，2.1times;106/mL，与空白对照组相比，分别显著下降36%、47%和57。 此外，如图所示。 1c在精子形态分析中，BDE-3处理组小鼠的精子尾部折叠率比空白组高1.4至2.2倍，尽管没有统计学差异。 香蕉门、大头、无定形、双头和双尾没有观察到明显的差异(图1。 S3)。

睾丸和附睾组织病理学。

与空白对照组相比，BDE-3 30mg/kg剂量组四只雄性（4/6）的曲细精管中的生殖细胞减少至最小。 2a，b. BDE-3 30毫克/千克剂量组三只雄性附睾中的成熟精子减少，1只动物的附睾管腔内有细胞碎片，附睾间质内有炎症细胞浸润(图1。 2c-h). 0.0015、1.5和10mg/kg剂量组小鼠未见微观上的变化。

最初，使用无监督的PCA观察QC样本与其他不同组睾丸、尿液和血清样本之间序列的稳定性。 从PCA模型得到的得分图表明，QC样品在正、负模式下聚集在一起，表明系统的稳定性是令人满意的(图1。 S4)。

采用PLS-DA模型充分区分对照组和BDE-3组的睾丸、尿液和血清代谢物。PLS-DA是一种识别有助于样品聚类的离子的有效方法。 它还有助于消除数据集内的非相关变化。

从PLS-DA模型的评分图表明，来自对照组和剂量组的睾丸样本分别聚集在一起，并清楚地相互分离(图1。 4). 此外，不同的BDE-3剂量表现出明显的分离趋势，表明BDE-3确实导致了组间的差异。 从尿液和血清样本的PLS-DA模型(图S5和S6)的评分图中也可以观察到类似的分离趋势)。

为了进一步区分睾丸代谢物，我们应用PLS-DA模型来表征对照和每个不同BDE-3组之间的差异。 通过UPLC-Q-TOF/MS方法(图S7和S8)，对照组和每个BDE-3组在不同剂量下存在明显的聚类。 详细的模型验证参数(R2X、R2Y和Q2)显示在图S7-S12上。 这显示了良好的适应和预测能力，以筛选不同的变量之间的小组。

相应的S图显示了不同变量对对照和BDE-3基团之间差异的贡献。 图中的每个点代表一个离子。 远离原点的离子对群体之间的差异非常重要，并且具有更大的VIP值。 采用独立样本t检验，评价统计显著性。 根据我们以前的方法，鉴定了在不同剂量(VIPgt;1，plt;0.05)下，BDE-3组与对照组的重要离子差异。 最后， 在睾丸中鉴定了76种不同的代谢物，并在表中列出1. 此外，我们还应用PLS-DA模型来表征各组尿液和血清样本之间的差异。 从PLS-DA模型的评分图表明，剂量组分别聚集在一起，并与对照组(图S5和S6)明显分离)。通过UPLC-Q-TOF/MS方法，对照组和每个BDE-3组在不同剂量下也有明显的分离(图S9-S12)。 我们使用T- Test方法筛选对照组和每个BDE-3组在不同剂量下发生显著变化的代谢物。 以Plt;0.05和VIPgt;1为切入，在尿液和血清中分别以阳性模式和阴性模式鉴定出38和31种不同的代谢物(见表2 还有3).

热图可以直观地显示对照和BDE-3基团之间差异代谢物的梯度变化。 构建了热图(图 5基于睾丸、尿液和血清中不同代谢物的归一化数据集。 根据我们的结果，在睾丸组织中，磷酸胆碱、L-卡尼汀、丙氨酸、肌酸、L-脯氨酸、cGMP、谷胱甘肽、D-葡萄糖6-磷酸、D-甘油1-磷酸、乙酰肉碱、UDP-葡萄糖、UDP-N-乙酰-D-半乳糖胺、L-酪氨酸、肌苷、D-潘替泰林4lsquo;-磷酸、还原型腺嘌呤二核苷酸(FADH2)、N-硬脂酰酪氨酸和PG(P-16： 0/14：1)在BDE-3处理组中均有增加。 与对照组相比，BDE-3组的亮氨酸、神经节苷脂GA2(d18：1/12：0)、神经节苷脂GM3(d18：1/12：0)、花生四烯酸（无过氧化物）、棕榈酸、皮质酮和脂质代谢物含量明显下降。

在尿液中(图。 与对照组比较，BDE-3组2-氨基腺苷、5-甲基胞苷、腺苷、阿列克辛、d TMP、L-谷氨酸、L- 半胱氨酸、L-脯氨酸酰胺、Lyso PC（16：0）、马隆肉碱、美戊酸、N-乙酰羟色胺、N-甲硫氨酸、烟酰胺N-氧化物、磷酰甘油、磷酸肌酸、肾上腺素、吡咯烷醇、Piroglutamic酸、S-（甲酰基）谷胱甘肽、苏烷甘氨酸、乌比喹酮(Q2)明显升高。 然而，代谢产物包括3-羟基-L-脯氨酸、乙酰丙酮酸、丙氨酸、beta;-羟基精氨酸、肌酸、D- Biotin、L-亮氨酸、L-托氨酸、L-酪氨酸、Lyso-PAFC-16、PG（22：4/0：0）、PG(P-20：0/0：0)、PGE2、还原核糖、Ribofavin(维生素B2)、琥珀酸酐、黄嘌呤酸被下调。 在血清中(图。 在BDE-3组中，N-乙酰-L-苯丙氨酸被下调。 然而，大多数代谢物被上调，包括L-脯氨酸、L-Valine、Ketoleucine、L-Leucine、2-苯丙胺、L- Methionine、4-咪唑酮-5-丙酸、L-Carnitine、L-苯丙氨酸、L-Tyrosine片段、硫酸苯基、L-Tyrosine、2-红烯酸、L-Tryptopin片段、Pyrocatechol硫酸盐、L-Topin、吲哚磺酸、Dodecanedioicacid、Inosine、Lyso PE（0：0/16：0）、LysoPE（18：1/0：0）、LysoPE（18：2/0：0）、LysoPC（16：1）、LysoPC（18：3）、LysoPC（18：1）、LysoPC（20：5/0：0），莱索PC（20：4）、莱索PC（20：3）、莱索PC（22：5）和胆酸葡萄糖醛酸。

上述方法用于鉴别不同代谢物。 采用该方法，我们共鉴定了睾丸中的76种不同代谢物、尿液中的38种不同代谢物和血清中的31 种不同代谢物。 详细信息见表1. 使用KEGG通路数据库(http

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