运用被改良磁性Fe3O4纳米粒子来提高固定化氨基酰化酶催化作用的活性和稳定性外文翻译资料

 2022-08-07 02:08

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运用被改良磁性Fe3O4纳米粒子来提高固定化氨基酰化酶催化作用的活性和稳定性

亮点：

APTES修饰Fe3O4磁性纳米粒子的合成。

酶的交联使得酶的空间效应更小，与游离酶更相似。

提高固定化酶的最适温度。

提高固定化氨基酰化酶的热稳定性pH稳定性和可重复利用性。

文章信息：

文章历史

2015年4月14日收到

2015年10月10日收到修订版

2015年10月26日接收

2015年10月31日在线提供

关键词：

磁性氧化铁（Fe3O4）纳米颗粒

氨基酰基化酶

固定化

共价键

摘要：

固定化氨基酰基化酶(酶代码EC 3.5.1.14)通过磁性氧化铁（Fe3O4）纳米颗粒与改性3 -（氨丙基）三乙氧基硅烷（APTES）共价键合。 磁性氧化铁（Fe3O4）纳米颗粒通过化学共沉淀制备并且控制n(Fe3 ):n(Fe2 ) = 2:1 and c(Fe3 ) c(Fe2 ) = 0.3 mol/L。用扫描电镜和红外光谱对APTES修饰的纳米颗粒进行了表征。结果显示最佳的纳米颗粒浓度，戊二醛浓度，交联时间和固定时间分别是8 mg/mL, 1.0%, 1 h, and 1.5 h。而且比较了游离酶和固定酶的最佳温度，pH和热稳定性。研究了固定化氨基酰基化酶重复使用的性质。

介绍

氨基酰基化酶(酶代码EC 3.5.1.14)是生物科技领域中十大最广泛使用酶之一，也被称作N-酰基-L-氨基酸氨基水解酶。氨基酰基化酶具有很强的光学性质将L-氨基酸酰化水解转化为L-氨基酸，从而分离L-氨基酸和D-氨基酸酰化水解。氨基酰化酶-I于1881年由Schmiedeberg首次在猪肾脏中发现。游离氨基酰基化酶的工业应用虽然有用，但必须回收和再利用，并且产品纯化工艺困难和成本高。因此固定化氨基酰基化酶被认为一种克服这些障碍的策略。大量研究已经研究固定化氨基酰基化酶在丙氨酸，蛋氨酸，缬氨酸和其他氨基酸中分离。游离氨基酰基化酶可以分离茶氨酸，这一事实已经引起人们在确定氨基酰基化酶是否能在纳米尺度上固定化。李等人。聚乙烯醇基纳米纤维膜固定化氨基酰化酶，导致高稳定性以及热稳定性。但是确定固定化氨基酰基化酶是否可以应用在磁性Fe3O4纳米颗粒上为了酶可以保留在催化方面与相应的游离酶相当性质是至关重要的。

磁性氧化铁纳米颗粒由于诸多优点在固定化酶领域越来越受重视，例如其制备简单，强磁响应，体积小以及易与反应溶液分离。磁性Fe3O4纳米颗粒由于其超顺磁性，量子尺寸效应和表面边界效应具有特殊的物理和化学性质。但是将酶直接固定在磁性氧化铁纳米颗粒上是困难的。因此几个研究专注于通过修饰其表面来改善磁性氧化铁纳米颗粒的制备，改性和分散。1992年de Cuyper等人用磷脂包裹的磁性纳米颗粒固定细胞色素c氧化酶，保留67%的活性。2008年杨等人开发了一种新的合成方式在MCM-41中孔内沉积铁前驱体或纳米粒子，产生了包裹的纳米颗粒。

但是磁性纳米颗粒缺失固定的氨基酰基化酶。相比之下，我们的研究使用化学共沉淀法来合成磁性氧化铁纳米颗粒。氯化铁和硫酸亚铁被用作反应物，氢氧化钠一滴一滴加入反应溶液中以及用永磁体收集磁性氧化铁纳米颗粒。我们选择用APTES修饰磁性氧化铁纳米颗粒是因为前者可以用氧化铁的羟基移植。然后，用戊二醛将氨基酰化酶固定在Fe3O4-APTES（也被称作氨基涂层Fe3O4）纳米粒子上（表1）。而且，在固定化氨基酰基化酶上进行了蛋白质结合率测定和酶活性测定。

材料和方法

化学品

米曲霉氨基酰化酶（酶代码EC3.5.1.14）(30,000 U/g)购自景春生物科技有限公司（上海， 中国）。DL-茶氨酸购自中国上海韩红化工科技有限公司。六水三氯化铁（FeCL36H2O），铁矾（FeSO4·7H2O），氢氧化钠（NaOH），APTES，无水乙醇，茚三酮，乙二醇甲基，乙醚，维生素C，乙酸和无水乙酸钠购自上海国药化学试剂有限公司（上海，中国）。戊二醛（50%）购自艾碧化工筹建有限公司（上海，中国）。

磁性Fe3O4纳米粒子的合成及表面改性

采用常规共沉淀法的改进制备磁性四氧化三铁纳米粒子。总之，在氮气保护下，将6.76gFeCL3·6H2O和3.48gFeSO4·7H2O(n(Fe3 ):n(Fe2 ) = 2:1) 的混合物溶解于100mL超纯水中。将溶液在60℃下搅拌3h，并通过滴加5.0mol/L NaOH将其pH调整至10.0。随后，用外部永磁体从反应混合物中分离出磁铁矿沉淀物，用超纯水和乙醇洗涤三次，并在50%（v/v）乙醇中重新悬浮，最终浓度为10 mg/mL。由于磁性Fe3O4纳米粒子的羟基能够与APTES侧链中的乙氧基反应，因此磁性Fe3O4纳米粒子的表面可以被APTES的氨基修饰。接下来，在氮气中向150ml磁性Fe3O4纳米粒子溶液中加入500micro;LAPTES，再将其悬浮在上面。在40℃搅拌24小时后，用永磁体收集氨基包覆的Fe3O4纳米粒子，用超纯水和乙醇洗涤三次，然后在60℃真空中干燥。最后，氨基包覆的Fe3O4纳米粒子在干燥条件下于4℃下密封保存。

氨基酰基化酶固定化

将氨基包覆的磁性Fe3O4纳米粒子溶解于磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH7.0）中，以确保最终浓度为4、6、8、10或12 mg/mL。超声在40 kHz下对溶液进行15分钟。然后，将0.25%至2.0%（v/v）的不同浓度的戊二醛溶液加入溶液中，然后在30℃下搅拌30 min至5 h的不同时间长度。用永磁体收集Fe3O4-APTES-戊二醛，用磷酸盐缓冲液（0.1mol/L，pH7.0）洗涤三次，去除未反应戊二醛。然后将Fe3O4-APTES-戊二醛复合物（最终浓度为8mg/mL）添加到氨基酰化酶溶液（最终浓度为3mg/mL）中，在15min-2h范围内固定几段时间。最后，磁性Fe3O4-氨基酰化酶纳米颗粒（也称为固定化氨基酰化酶）被永磁体分离，并用磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH7.0）洗涤三次以去除游离酶。如上所述，逐步研究了不同量的Fe3O4-APTES-戊二醛纳米颗粒、最终戊二醛浓度、交联时间和固定化时间对蛋白质结合率和酶活性的影响。

Fe3O4和Fe3O4-APTES的表征

将氨基包覆的磁性Fe3O4纳米粒子溶解于不同的溶剂（水、乙醇、甲醇、异丙醇、环己烷、甲苯、乙酸乙酯和石油醚）中，测定其溶解度。

对于扫描电子显微镜，用KBr将干燥的Fe3O4和Fe3O4-APTES固定在载玻片上，然后进行喷金。在25千伏的日立S4800电子显微镜（日立，日本）上观察样品。

傅里叶变换红外光谱（FT-IR）谱图是在测试波长为400–4000 cm-1，间隔为1 cm-1，不包括背景空气的Nicolet 6700红外光谱仪（Thermo Fisher Scientific，USA）上进行的16次扫描中获得的。

蛋白质结合率和酶活性测定

用Libra S22分光光度计（英国Biochrom）测量吸光度。用分光光度计测定固定化

前(ODbefore) 后(ODafter) 氨基酰化酶溶液在595nm处的吸光度，计算蛋白结合率，得到：蛋白结合率=（ODbefore -ODafter）/ODbefore times;100%。

接着，将40毫升磷酸盐缓冲液（0.1摩尔/升，pH7.0）与5毫升超纯水和5毫升0.2摩尔/升DL-茶氨酸在250毫升锥形瓶中混合，并在42℃下保持5分钟。然后加入20毫克固定化氨基酰化酶或游离酶，在42摄氏度下振动溶液。30分钟后，立即将反应溶液放入沸水中，停止反应。然后，将1毫升溶液与茚三酮混合并充分摇匀。在570nm处获得吸光度，从标准曲线中鉴定茶氨酸含量。氨基酰化酶活性的一个单位定义为在分析条件（42℃，pH 7.0）下每小时1 lmol L-茶氨酸释放的氨基酰化酶量。初始酶活设为100%，计算相对酶活。

温度和pH的影响

为了获得最佳反应温度，在不同温度下对第2.5节中描述的相对酶活性进行了评估。将40毫升磷酸盐缓冲液（0.1摩尔/升，pH7.0）与5毫升超纯水和5毫升0.2摩尔/低密度脂蛋白茶氨酸在250毫升锥形瓶中混合，并在不同温度下（29至72摄氏度）保持5分钟，然后添加20毫克固定化氨基酰化酶或游离酶，并在42摄氏度下振动溶质。30分钟后，立即将反应溶液放入沸水中，停止反应。然后，将1毫升溶液与茚三酮混合并充分摇匀。在570nm处获得吸光度，从标准曲线中鉴定茶氨酸含量。初始酶活设为100%，计算相对酶活。

此外，还研究了最佳pH值。在其最适温度，pH 5.0、6.0、7.0、8.0和9.0条件下，对固定化氨基酰化酶和游离酶进行了相对酶活性测定。

固定化氨基酰化酶的稳定性

将相同量的游离或固定化酶在不同温度（29、42、52、62和72℃）下保持1h，然后在给定酶的最佳温度和pH下进行第2.5节所述的酶活性测定。初始酶活性（设为100%）用于计算相对酶活性以确定热稳定性。

固定化氨基酰化酶活力循环测定6次。每次固定化氨基酰化酶用永磁体分离，用磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH7.0）洗涤3次，然后按第2.5节所述进行酶活性测定。初始酶活性（设为100%）用于计算相对酶活性，以确定固定化氨基酰化酶的稳定性。

结果和讨论

Fe3O4和Fe3O4-APTES的合成与表征

氨基包覆的Fe3O4纳米粒子在亲水性溶剂（如水、乙醇、甲醇和异丙醇）中表现出高度的分散性和稳定性（图1a左侧）。然而，由于磁性四氧化三铁纳米粒子上的亲水性氨基涂层，它们不溶于疏水性溶剂，如环己烷、甲苯、乙酸乙酯和石油醚（图1a右侧），由于磁性Fe3O4纳米粒子上的亲水性氨基涂层[16]。因此，固定化氨基酰化酶在工业生产的油/水反应系统中具有潜在的应用前景，因为该产品可以在油相充分收集以保证安全性，并且固定化氨基酰化酶可以被永磁体分离和回收（图1b）。由于其超顺磁性，固定化氨基酰化酶（作为催化剂）可应用于外加磁场的毛细管微反应器[18]。

用扫描电镜观察了Fe3O4和Fe3O4-APTES的尺寸和形貌（图1c和d）。未经改性的Fe3O4由10-30nm大小的纳米颗粒团簇组成。Fe3O4-APTES团聚体的大小在30-70nm之间，平均为40nm。与Fe3O4相比，Fe3O4-APTES具有更大的粒径和更大的粒径均匀性，表明APTES与磁性Fe3O4纳米粒子连接。

红外光谱用于确保改性成功（图1e）。红外光谱表明，3420cm-1处的吸收峰为O-H伸缩振动，1633cm-1处为O-H形变振动。C-H拉伸振动的吸收峰位于2934cm-1。1000cm-1处的峰值属于Si-O键的弯曲振动。584cm-1处的吸收峰属于Fe3O4中Fe-O键的拉伸振动模式。与Fe3O4（i）的红外光谱相比，Fe3O4-APTES（ii）的红外光谱在584和1000cm-1处出现了较大的吸收峰，这表明Fe–O–Si键已经形成，而在3420、2934和1633cm-1处的吸收峰几乎没有差别[16]。这些特性表明表面改性是成功的，并且APTS与磁性Fe3Olt;

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