工程生物活性自愈抗菌外泌体水凝胶促进慢性糖尿病伤口愈合和完全的皮肤再生外文翻译资料

 2022-08-08 11:08

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工程生物活性自愈抗菌外泌体水凝胶促进慢性糖尿病伤口愈合和完全的皮肤再生

摘 要

基本原理:慢性非愈合糖尿病伤口治疗和完全的皮肤再生仍然是一个关键的临床挑战。从多功能水凝胶中控释生物活性因子是一种很有前景的治疗慢性创伤的方法。

方法:在此，我们首次开发了一种可注射、自愈、抗菌的基于多肽的FHE水凝胶(F127/OHA-EPL)，并释放刺激响应脂肪来源间充质干细胞外泌体(AMSCs-exo)，协同促进慢性伤口愈合和完全皮肤再生。对该水凝胶的材料表征、抗菌活性、刺激细胞行为以及在体内糖尿病全层创面的愈合能力进行了分析。

结果:FHE水凝胶具有快速的自愈过程、剪切稀释注射能力、高效的抗菌活性和长期ph响应的生物活性外泌体释放行为等多功能特性。在体外，FHE@exosomes (FHE@exo)水凝胶显著促进人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的增殖、迁移和成管能力。在体内，FHE@exo水凝胶显著提高了糖尿病全层皮肤创面的愈合效率，其特点是伤口愈合率提高，创面内血管生成、再上皮化和胶原沉积速度加快。此外，FHE@exo水凝胶的愈合效果优于外泌体或单独使用FHE水凝胶，表明外泌体和FHE水凝胶的持续释放可以协同促进糖尿病创面愈合。在FHE@exo水凝胶治疗的伤口中也出现了皮肤附属物和较少的疤痕组织，表明其具有实现完全皮肤再生的强大能力。

结论:这项工作提供了一种通过控制外泌体释放的多功能水凝胶完全修复慢性伤口的新方法。

关键词:多功能水凝胶，生物活性外泌体，响应性缓释，糖尿病创面愈合

介绍

糖尿病创面已成为糖尿病相关截肢的重要原因之一，患者医疗费用高，生活质量差。正常的伤口愈合是一个复杂的生物学过程。涉及三个典型阶段:炎症、增殖和重塑，其中涉及多种类型的细胞、细胞因子和细胞外基质[2]。糖尿病创面愈合不良的机制尚不清楚，但这种可怕的糖尿病并发症的原因主要是缺氧、血管生成障碍、活性氧(ROS)损伤和神经病变，导致长期的医疗负担和患者的生活质量下降[3]。糖尿病创面的常规临床治疗包括手术清创和伤口敷料负压治疗[1,4]。然而，由于伤口周围的细胞功能受损，这些治疗对许多患者来说似乎无效[5]。要解决这些问题,基于间充质干细胞(msc)的疗法由于其招募细胞和释放生长因子和蛋白质的能力而显示出伤口愈合的巨大潜力，然而由于免疫排斥、有限的分化和增殖能力以及干细胞的染色体变异，问题仍然出现[6、7]。近年来，有研究表明，移植干细胞治疗可能通过旁分泌机制而不是直接分化来发挥其功能，特别是通过分泌细胞外囊泡[8,9]。外泌体是纳米大小的囊泡(40-150纳米)，被认为是MSCs的主要分泌产物，可以通过将所含mRNAs、miRNAs和蛋白质转移到靶细胞来调节细胞间的通讯，并促进伤口愈合[6]。此外，它们具有免疫耐受性，具有类似于其来源细胞的生物学功能，并可作为MSCs治疗[10]的可能替代品。血管生成是决定糖尿病创面愈合结果的关键因素[2,11]。最近的研究也表明外泌体可以通过加速血管生成来促进伤口愈合，这在糖尿病伤口治疗中有很大的应用前景[12,13]。例如，Guo等人报道来自富含血小板血浆的外泌体可以通过YAP激活促进皮肤慢性伤口愈合[14]。然而，外泌体常用的给药方式是注射，由于外泌体的清除率[15]快，会影响外泌体的功能。另一方面，糖尿病伤口的修复和再生需要较长的愈合时间。因此，有必要开发一种新型的生物相容性支架，作为外泌体的缓释载体，以维持外泌体在糖尿病创面区域的生物活性，并进一步加速创面愈合。

生物医学水凝胶，在结构上类似于天然ECM，被认为是有希望为伤口治疗输送药物/细胞的生物材料[16,17]。理想的创面愈合水凝胶支架应具备以下特点:适当的力学性能、良好的保水性、抗感染能力、可注射能力和良好的细胞生物相容性[18]。自愈水凝胶在外力损伤后表现出快速自主的自愈能力，可能在伤口愈合过程中保持其结构的稳定性[19,20]。具有抗菌活性的水凝胶具有预防感染、吸收伤口液体和提供气体交换等优点。目前的抗菌材料包括无机金属离子或纳米颗粒、产生活性氧(ROS)分子、抗菌肽等，它们也有自身的缺点，如潜在的细胞毒性、利用的局限性、生产率低、生产成本高[22-25]。水凝胶的注射和粘附能力使其具有良好的可操作性，在愈合过程中可长期附着在创面上[26-28]。特别是水凝胶具有良好的细胞生物相容性，能够促进细胞增殖和分化[29]。含有胺基的水凝胶支架显示了其增强生物相容性和与宿主组织整合的潜力[30]。聚-ε-赖氨酸(EPL)是白链霉菌产的天然阳离子多肽，具有良好的生物降解性、固有的抗菌活性和生物相容性。美国FDA已批准EPL用于临床或作为食品级阳离子抗菌药物[32]。此外，EPL中的赖氨酸残基可以通过表面修饰合成生物医学水凝胶。例如，EPL和聚乙二醇水凝胶具有粘接性能，可用于组织再生。另一方面，以水凝胶为基础的外泌体输送可能会在伤口愈合过程中促进血管生成和组织形成。最近的研究还表明，使用水凝胶传递外泌体以恢复血管化和促进伤口愈合的应用[34,35]。以壳聚糖为基础的外泌体水凝胶已被开发用于加速血管生成和伤口愈合[33]。然而，在[36]报道中，由具有多种外泌体传递和组织再生功能的天然多肽组成的水凝胶非常罕见。因此，研制一种可注射的、具有抗菌活性的自愈合粘性水凝胶是非常必要和有前景的。

在这项研究中，我们开发了一种具有固有抗菌活性和对PH敏感的长期外来体释放的可注射自愈合多肽基水凝胶（方案1）。该多功能水凝胶由Pluronic F127 (F127)、氧化透明质酸(OHA)和EPL(表示为FHE水凝胶)组成。通过OHA和EPL之间可逆的席夫碱反应和F127的热响应特性形成了FHE水凝胶(方案1B)。在这种水凝胶中，OHA提供了保水能力和生物相容性，EPL提供了固有的抗菌活性和粘附能力，F127提供了热响应凝胶化，席夫碱键(OHA和EPL)赋予了自愈合性能。脂肪间充质干细胞(AMSCs)衍生的外泌体具有代表性的负电位，可通过外泌体与EPL之间的静电相互作用加载到水凝胶中。由于席夫碱键的断裂，外泌体可以在弱酸性环境下被释放。在此，我们首次报道了自愈合多功能FHE水凝胶可用于传递生物活性外泌体，以促进糖尿病伤口愈合和皮肤再生。研究了FHE水凝胶中释放的长期外来体对血管生成和糖尿病伤口愈合的影响肤再生。

结果与讨论

FHE水凝胶的理化结构表征

FHE水凝胶的示意图如方案1所示。首先，醛基通过高碘酸钠氧化引入HA(方案1A)。氧化后的HA通过1H NMR进行了鉴定，其中4.9 ppm和5.0 ppm的新峰对应于醛基和相邻羟基的质子(图S1)。采用盐酸羟胺法测定聚合物中醛基的数量，从而定量HA的实际氧化度，结果见表S1。氧化的透明质酸(OHA)可以与EPL中的氨基反应形成席夫碱(方案1B)。将F127和EPL溶液与OHA溶液混合，在37℃下约10 s时间内形成100 mu;l的水凝胶(方案1C-D)。通过FTIR分析确定了水凝胶的化学结构(图1A)。在1660 cm-1处的峰被认为是来自EPL和HA的羰基(-C=O)醛基上。

方案1可注射多功能FHE水凝胶的合成

(A)氧化透明质酸的合成;(B)氧化HA与多肽(ε-聚l -赖氨酸，EPL)的席夫碱反应;(C)由F127-EPL和氧化HA组成的双网络水凝胶的热响应性溶胶-凝胶过程;(D) FHE水凝胶的溶胶-凝胶转变的光学图像。

氧化透明质酸（OHA）中醛基伸缩在1735cm-1。1467 cm-1和1342 cm-1的双峰归属于F127的醚键(- c - o - c -)。在FHE水凝胶中1735 cm-1处的峰消失表明OHA与EPL反应成功。此外，冻干后的FHE水凝胶呈现出典型的三维多孔形貌，EPL含量对孔结构没有明显影响(图1B)。

FHE水凝胶的多功能性能评价

测试了FHE水凝胶在不同条件下的流变性能，以评价其力学行为(图1C-F)。在4℃时，F127和FH组的储能模量(G )明显低于损失模量(G )，说明它们的粘度较低(图1C)。然而,对于FHE5和FHE10组，G 比G 高，表明加入OHA和EPL后粘度增加(图1C)。在4°C显著低模量(大约10 Pa) 表明各种水凝胶应该处于溶胶状态，而不是凝胶状态(方案1)。所有水凝胶的Grsquo;和G”在温度25℃和37℃都明显增加，并且在所有组中，Grsquo;显著高于G”，表明水凝胶形成。此外，流变学分析和宏观实验用于评价FHE水凝胶的自愈性能(图1D-G)，使用F127和FH作为对照。当阶跃应变从1%变化到1000%时，各种水凝胶的G′从~10kPa显著降低到数Pa(图1D)。经过2个循环的阶梯应变，F127和FH水凝胶的G′呈显著降低，而FHE-5和FHE-10水凝胶的变化可以忽略不计(图1E)。G 的降低是由于高动态应变(1000%)导致水凝胶网络的崩溃。释放至1%后，FHE-5和FHE-10水凝胶迅速恢复到初始G 值，表明其水凝胶结构恢复(图1D-E和图S2A-D)。我们还测试了水凝胶在愈合前后的流变性能(图1F)。FHE-5和FHE-10水凝胶的G 没有明显差异，表明其恢复速度快(图S2E)。在dydrogel的缺陷中加入新的水凝胶后，FHE-5水凝胶在16 h内对缺陷进行了修复(图1G)，修复后的水凝胶与初始水凝胶的流变性能和结构无显著差异(图S2G和S2K)。FHE-5水凝胶可通过内径为0.8毫米、长度为10厘米的医用塑料导管挤出而不会堵塞，并在注射后以“大鼠”形状恢复凝胶状态，表明其具有良好的可注射性(图1 h)。FHE水凝胶的可注射性还表现在其剪切稀释性能(图S2F)。FHE-5水凝胶对皮肤也表现出很好的粘附能力，这可能有利于伤口的愈合过程(图1I)。自愈合水凝胶的机理可能基于动态席夫碱键(图1J和S2H-J)[37,38]。由于抗菌多肽(EPL)的存在，FHE水凝胶表现出了强大的抗菌活性(图S3)。与F127水凝胶相比，FHE水凝胶在培养2 h后能有效杀灭大肠杆菌(革兰阴性菌)(图s3b)和金黄色葡萄球菌(革兰阳性菌)(图s3b - d)。与F127-HA (FH)孵育后大肠杆菌和金黄色葡萄球菌数量显著增加，表明FHE水凝胶具有良好的抗菌能力。13天后，FEH -5水凝胶在体外表现出具有代表性的ph响应性降解;重量残留约为20% (pH 7.4)和1% (pH 5.5)，表明FHE-5水凝胶也大部分在体内(皮下)降解(图S4)。FHE水凝胶具有注射性、自愈性、抗菌性和粘附性等多种功能，在伤口愈合方面具有广阔的应用前景。

图1 FHE水凝胶的理化结构及多功能性质。

(A) FTIR显示化学结构;(B)显示多孔形貌的SEM图像;(C)不同水凝胶在4、25和37℃下的流变学性质，即G和G ';(D) 37℃下，从1%阶跃应变到1000%，各水凝胶的G和G ';(E) 37℃下1000%步进应变循环两次后各水凝胶的G 回收率;(F)初始水凝胶和愈合后水凝胶的G′;(G) FHE-5水凝胶自愈性能的图片;(H)显示FHE5水凝胶通过导管注射能力的照片;(I)展现FHE-5水凝胶对皮肤粘附特性的图像;(J) FHE水凝胶自愈过程示意图。

外泌体特性、释放特性和HUVECs体外生物相容性评价

通过流式细胞术分析CD90和CD44的阳性表达以及CD45和CD34的阴性表达来表征获得的骨髓间充质干细胞(图2)。然后通过AMSCs条件培养基的差动离心收集AMSCs衍生的外泌体。对纯化的外泌体进行TRPS分析、TEM和western blotting鉴定。TRPS测量显示，AMSCs来源的外泌体大小约为60-80 nm(图2A)，这与之前报道的外泌体大小分布一致[39]。TEM显示，AMSCs衍生的外泌体呈杯状或圆形，尺寸小于100 nm(图2B)，这与TRPS分析的数据一致。Western blotting表明，这些外泌体对Alix、CD9、CD63和CD81等特征外泌体表面标记蛋白呈阳性(图2C)，其他研究也对此进行了描述[15,40]。这些结果表明，本研究成功获得了amscs来源的外泌体。

外泌体释放曲线如图3A和B示。具有生物活性的外泌体被有效地包裹在FHE水凝胶中，并表现出具有代表性的长期ph响应的持续释放行为。为了研究AMSCs来源的外泌体的血管生成能力，采用transwell共培养系统。采用CCK-8细胞计数法检测游离外泌体或FHE@exo水凝胶对HUVECs增殖的作用。结果显示，与对照组相比，FHE水凝胶处理的HUVECs具有相同的增殖能力，但与游离外泌体组相比，FHE水凝胶持续释放外泌体可显著增强HUVECs的增殖能力(图3C)。结果表明，FHE水凝胶具有良好的生物相容性和对HUVECs无细胞毒性。此外，与一次性处理外泌体相比，从FHE水凝胶中持续释放外泌体可以显著增强HUVECs的增殖，说明FHE水凝胶可以增加或至少保持释放的外泌体的生物活性，是外泌体持续释放的良好载体。

血管生成是新血管形成的生物学过程，涉及内皮细胞的增殖、迁移和血的形成，新形成的血管可以将氧气和营养输送到创面部位，从而决定糖尿病创面愈合的结果

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