营养菌的生长动力学和苯酚的生物降解恶臭假单胞菌 LY1外文翻译资料

 2022-08-07 02:08

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营养菌的生长动力学和苯酚的生物降解恶臭假单胞菌 LY1

李莉*，李静，王超，王培芳

河海大学环境科学与工程学院，浅水湖泊综合调控与资源开发教育部重点实验室，南京西康路 1 号，江苏南京 210098

摘 要

这项研究调查了精神营养型恶臭假单胞菌 LY1 的生长动力学，同时它以苯酚作为唯一碳和能源而生长。该细菌可以在 2.5 至 35°C 的温度范围（最佳温度为 25°C）下完全降解 200 mg / L 的苯酚。高初始苯酚浓度（800 mg/ ml）抑制细菌生长。在较低的苯酚浓度下，生长动力学与 Haldane 模型具有良好的相关性。精神营养恶臭假单胞菌 LY1 的 Haldane 参数几乎在先前文献中报道的其他生物范围内。有关精神营养生物的信息对于受污染环境的低温生物修复非常重要。

关键词：

苯酚 生物降解 动力学 精神营养 恶臭假单胞菌

1. 介绍

酚类化合物具有高度的毒性和致癌性，由于其稳定性和生物蓄积能力，可以在环境中长期存在。据报道，一些酚类物质降低了各种微生物的化学需氧量（COD）和氮磷吸收（Kargi等人，2005年），表明酚类污染也可能对微生物群落产生影响。由于酚类物质在许多不同的工业过程中被广泛使用，因此需要安全有效的处理酚类废物的方法。

在酚类化合物中，苯酚是一种最严重的环境污染物，目前在土壤和地下水中普遍存在（Li and Loh，2005）。由于其毒性（酶抑制）和即使在相对较低的水平下对鱼类的杀伤力（例如，5-25 mg/L），其从工业来源排放到环境中也是非常令人担忧的（Brown等人，1967）。典型的印度炼油厂每年处理500万吨原油的废水中总酚浓度约为135毫克/升（Mukherjee等人，2007年）。高浓度的苯酚通常用于工业苯酚生产废水，有时达到3000-4000 mg/L（Godjevargova等人，2003），特别是橄榄油厂废水中苯酚化合物的浓度甚至高达10000 mg/L（Borja等人，1992).美国环境保护署（US EPA）为地表水中的苯酚设定了低于 1.0 lg / L 的水净化标准。

常规的物理和化学废物处理方法通常具有严重的缺点，包括高的初始投资和较大的运营成本。此外，这些过程通常还会产生其他有害副产 物（Atlow 等， 1984;Matatov-Meytal 和 Sheintuch，2002 年).在用于净化污水的各种方法中，目前认为生物降解是最环保和最具成本效益的。因此，苯酚的生物处理已成为预防污染中越来越重要的过程。尽管已经 测试了许多不同的微生物降解苯酚的能力（ Alexievaa 等， 2004 ； Arutchelvan et al., 2005;Bai 等，2007；Bajaj 等，2009；Hao 等， 2002；江 et al., 2005;赫列法特，2006 年；Wang 等，2008），几乎没 有关注可以在低温下起作用的微生物。关于低温对细胞生长和苯酚生物 降解的影响的信息很少，因为大多数研究中的实验温度通常高于 25°C。但是，大多数废水处理厂的工作温度范围为 0 至 30°C（Ahsan 等，2001； El Hajjouji 等， 2008;Ghosh et al., 1999;Luostarinen 和 Rintala， 2007；穆勒 et al., 1995;Shpiner 等，2009；Sirotkin 等，2001).

因此，寻找一种能够适应环境温度日变化和季节变化的生物是十分必要的。冷适应微生物在土壤和废水地区有潜在的应用价值一年中的大部分时间必须在低温下进行处理。根据生物体使用的定义，这些生物可分为嗜神经性和精神营养性（或抗精神病性）生物。 森田（1975）.嗜冷菌是分别具有最低，最佳和最高生长温度分别为60、615 和 620°C 的生物。精神营养菌的相应温度为 0-5，gt; 15 和gt; 20°C（Margesin 和 欣纳，1997 年；森田（Morita），1975 年； Wijnands 等，2006).这些范围表明，在许多情况下，最有趣的生物是精神营养生物，因为它们在 20°C 以上的温度下也具有活性。因此， 在更多的环境中，每年可能更长的时间比嗜冷菌更活跃。

因此，本研究的目的是研究能够在降低的温度下起作用的生物体 的细胞生长和酚类生物降解，这种降低的温度在实际废水处理条件 下更常见。检查了精神营养微生物恶臭假单胞菌 LY1 的生长和苯酚降解能力，并将其与其他适合室温生长的微生物进行了比较。

2. 方法

2.1. 微生物和培养条件

恶臭假单胞菌从河流沉积物中分离出来，并接种到装有从松花江 收集的河水的塑料容器中。唯一提供的碳源是 20 mg / L 苯酚。细菌生长到指数生长期（107 细胞/ mL）后，就可以用于生物降解实验了。通过定期在营养琼脂斜面上进行亚转移来维持恶臭假单胞菌的 原种，并在 4°C 的冰箱中保存。如以下所述制备每个实验的苯酚诱导接种物 Li 等。（2007 年）.培养物在 25°C 和 120 rpm 的 WHY-2 恒温振荡器上，在装有 200 mL 培养基的 250 mL 锥形瓶中生长。

2.2. 矿物培养基

无机盐培养基由（g / L）组成：Na 2 HPO 4-12H 2 O，3.80； H 2 O 3 。KH2PO4, 1.00; 氯化钠， 1.00 ； 硫酸镁 0.20;NH4Cl, 0.10的去离子水中用 NaOH 调节pH 至 7.2。

在使用之前，将所有培养基（苯酚除外），移液器吸头和装有棉 塞的锥形瓶在 121°C 高压灭菌 20 分钟以进行灭菌。接种后，将制备好的储备溶液中测得的苯酚量直接添加到每个烧瓶中，以得到所需 的初始浓度。将苯酚溶解在 0.02 N NaOH 中，制成 10,000 mg / L 的储备溶液。

2.3.生物降解实验

最初在添加 200 mg / L 苯酚的不同温度（2.5、5、15、25、35、45、45°C）下研究了分离细菌对苯酚的生物降解作用，以确定最佳的苯酚降解温度。每个 250 mL 烧瓶中含 200 mL pH 7.1-7.3 的无机盐培养基，每毫升含 107 细胞。用棉塞密封烧瓶，并以 120 rpm 摇动。在适当的时间取样观察苯酚的去除和细胞密度。必要时进行对照实验。

类似的实验在25℃、 以不同初始苯酚浓度（20、30、40、50、60、70、90、110、200、310、380、800mg/L）为实验温度，研究苯酚浓度对细胞生长和苯酚生物降解的影响。

2.4.分析方法

定期取出 5 毫升样品进行分析。用 pH 电极和 pH 计（Orion 3 Star，美国）监测 pH 的变化。使用 Xinmao 紫外分光光度计 UV-7504 从 600nm 处的光密度（OD）测量值确定细胞浓度。然后使用以下公式将 OD 值转换为干细胞质量：DCW（mg / L）=314.5 x OD600.

通过用 6 N H2SO4 将 5 mL 样品酸化至 pH 2 来淬灭生物降解反应来确定酚浓度。然后将酸化的样品在 3800 rpm 下离心15 分钟然后用 5mL 二氯甲烷萃取苯酚。然后将提取物的 1 L 等分试样进行分析。

使用配有分流进样器和火焰离子检测器的毛细管气相色谱仪（Trace GC2000） 裂解苯酚。载气为氮气。进样器和检测器的温度分别为220°C 和 280°C。样品以 20：1 的比例分流。烤箱温度曲线从 100°C 开始持续 1 分钟，然后以 10°C / min 的速度升至 160°C，此后停止程序。苯酚的保留时间为 2.09 分钟。浓度测量的可重复性通常在 3％ 以内。

3. 结果和讨论

3.1. 孵育温度对细胞生长和苯酚生物降解的影响

图1 显示了在不同温度（2.5–45°C）下恶臭假单胞菌 LY1 的比生长速率和苯酚的生物降解率。当以苯酚为唯一底物时，恶臭假单胞 菌 LY1 的最佳生长温度在 25℃左右，这与 P. ida 获得的结果吻合良好。Li 等。（2007 年）.但是，恶臭假单胞菌在 45°C 时完全生长受到抑制。

根据定义森田（1975），表明 LY1 是一种精神营养细菌，其对被苯酚污染的环境进行生物修复的潜力可能发生在 2.5°C 至 35°C 的宽范围温度范围内。当考虑在年度温度明显波动的受污染地区进行修复 时，这些结果特别有用。

3.2. 苯酚的生物降解与细胞生长

3.2.1. 苯酚浓度对细胞生长和苯酚生物降解的影响

我们在 25°C 下观察到最高的比生长速率和苯酚生物降解速率。在25°C 下，接种的细菌能够在 20–380 mg / L 的浓度范围内降解苯酚。观察到一个延长的滞后阶段，范围从 0 到 25 h。初始苯酚浓度为 200 和 310 mg / L 时的苯酚降解测试结果（苯酚浓度和细胞生物量）显示于图 2（A）和（B）。这些图显示细胞生长遵循滞后阶段的批量生长曲线，其中未 观察到底物或生物质浓度的明显变化。随后是指数生物降解阶段， 其中发生了生物量的增长和苯酚的同时转化。最后，曲线显示出随 着底物耗尽而下降。细菌生长被完全抑制，并且在较高的苯酚浓度（800 mg / L）下未观察到生物降解。

滞后阶段从 0 到 25 小时不等，滞后时间越长，初始苯酚浓度越高。这种特征行为可以通过生物量的增加和自我抑制来解释。滞后阶段完成 后，细胞量就会显着增加。由于底物利用率与生物质浓度成正比，因此 响应于增加的生物量，在测试过程中底物利用率加快了。通过自抑制作 用增强了生物量的作用。正如本文稍后所定量的，苯酚具有自抑制作用。因此，随着最初的高苯酚浓度降低，自抑制被减轻，从而进一步加速了 底物的利用。即使完全利用了苯酚，分批运行结束时的生物质浓度也会增加（图 2(B)).假单胞菌菌株与苯酚（Hao 等，2002；塞兹和里特曼， 1993 年).这种现象可以由以下事实解释：苯酚首先被生物转化为中间代谢物，在本实验中未进行测量，并且这些代谢物一直作为底物， 直到被细菌完全降解为止。

3.2.2. 细胞生长的特征

生物量浓度与苯酚浓度的时间无关图的典型示例如下所示：图 3， 用于初始苯酚浓度为 310 mg / L 的实验。在大多数活跃的生长期， 生物量和苯酚浓度呈线性关系。所有实验的相关系数均高于 0.99， 在活跃生长期内平均生长产量（Ym）值为 0.4025 mg 生物量/ mg 苯酚（表格 1).较低的生长产量值可归因于恶臭假单胞菌 LY1 的较低的代谢效率。例如，较高的生长产量值分别为 0.65 和 0.43–0.94 和0.5–0.6 分别由 Kumar 等。（2005），王和 卢（1999）和 Monteiro 等。（2000 年）

用于在苯酚上生长的其他恶臭假单胞菌菌株。在这项工作中获得的平均值在 Halobacter halobium（ 卤化细菌） 报道的0.40–0.56 mg 干细胞/ mg 苯酚范围内（Peyton 等，2002).

如图所示表格 1，苯酚的滞后期和最高细胞浓度随着初始苯酚浓度的增加而增加。

苯酚降解率总体呈上升趋势，在310 mg/L苯酚初始浓度下达到最大值5.55 mg/（L h）℃为0.040～0.122（1/h），平均值为0.096（1/h）。当苯酚浓度为50mg/L时，生长速率达到最大值；低于此浓度时，由于底物的限制，生长似乎不太理想；高于此浓度时，由于底物的抑制，生长越来越受到抑制。当初始苯酚浓度为20-380mg/L时，生长率在0.136-0.765之间变化（表1）。这一结果不同于以前的一些报告，其中Y几乎是常数（Hao等人，2002年；Kim和Hao，1999年；Saeacute;z和Rittmann，1993年）。然而，这与王和罗（1999）的结果相似，他们发现产量系数当苯酚初始浓度为25～800mg/L时，其变化范围为0.43～0.94。

3.2.3. 霍尔丹模型

Haldane 方程，由于其数学简单性和代表响应中的生长动力学而被广泛接受对于抑制底物，适用于描述恶臭假单胞菌 LY1 细胞在苯酚上的生长动力学。分批生长的生物质浓度 X（mg / L）可以建模为：X=X0eut (1)

使用 Haldane 方程，用苯酚的初始浓度对在苯酚上生长的细胞的比生长率 l（1 / h）进行建模，如下所示：

其中mu;max为最大比细胞生长速率（1/h），S为苯酚浓度（mg/L），Ks为饱和常数（mg/L），Ki为自抑制常数（mg/L）。较高的Ki意味着培养物对底物抑制的敏感性较低。

在初始苯酚浓度为20~800mg/L的培养基中培养大白蛾LY1的分批培养。对于每个分批培养基和初始苯酚浓度，通过对生物量浓度随培养时间的半对数图进行线性最小二乘回归估计比生长率指数增长阶段。霍尔丹方程拟合了我们的实验数据和相关性很好（图4）。Lmax=0.217（1/h），KS=24.4mg/L，Ki=

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