来源于红树林内生菌稀有的细菌产caryolanes类代谢产物Bacaryolanes A−C外文翻译资料

 2023-01-03 11:01

来源于红树林内生菌稀有的细菌产caryolanes类代谢产物Bacaryolanes Aminus;C

原文作者 Ling Ding，dagger; Helmar Goerls，Dagger; Katharina Dornblut，dagger; Wenhan Lin，sect; Armin Maier，perp; Heinz-Herbert Fiebig，perp; and Christian Hertweck*，dagger;，∥

单位

dagger;Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biologyminus;Hans Knöll Institute (HKI), Beutenbergstraszlig;e 11a, 07745 Jena, Germany

Dagger;Institute for Inorganic and Analytical Chemistry, Friedrich Schiller University, Humboldtstraszlig;e 8, 07743 Jena, Germany

sect;State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, Peking University, Beijing, Peoplersquo;s Republic of China

perp;Oncotest GmbH, Am Flughafen 12-14, 79108 Freiburg, Germany

∥Friedrich Schiller University, 07737 Jena, Germany

摘要：Caryolanes类化合物是典型的植物衍生而来的倍半萜。 在这里我们将对红树林植物木榄内生菌（Streptomyces sp.JMRC：ST027706）产生的三种caryolanes类化合物bacaryolane A-C（1-3）的分离及结构解析通过二维核磁共振谱，X-射线晶体学数据，CD光谱以及与植物源caryolanes类化合物的数据进行比较等方法进行全面阐述。我们严格分析了来自细菌的bacaryolanes以及相关化合物的绝对构型。 细菌源caryolanes是典型的植物源caryolanes类衍生物的镜像。 显然植物和细菌具有不同生物合成途径，因此可以用作代谢标记。 内生菌中植物样挥发性萜烯的发现不仅是对细菌萜类化合物的重要补充，而且对探究植物—微生物之间复杂分子相互作用具有重要意义。

萜类化合物是最大的次级代谢物，具有近400个不同的结构家族，这是由酶促环化和重排反应引起的。由于它们的结构多样性，萜类具有广泛的生物学功能，如香料，阻碍剂，激素，维生素和治疗剂等。通常，萜烯被认为是植物和真菌代谢物的标志。但是，对土壤气味起主导作用的细菌产生的萜类geosmin和2-甲基异山梨醇长期以来认为是稀有化合物。

因为产率低，分离的困难和缺乏发色团，大多数细菌萜烯没有被发现。然而，通过基因组挖掘方法，发现萜烯合酶和环化酶的基因广泛分布在细菌中，特别是放线菌中。利用与现代分析工具结合的生物合成知识，可以从野生型微生物发现各种细菌萜烯。已知的或新的细菌萜烯通过基因簇或单个萜环化酶基因的异源表达产生。迄今为止，细菌萜类化合物的生态功能仍然不太确定。但是，值得注意的是，稳定生长的细菌“萜类化合物”包括许多植物源萜类化合物，极有可能从植物中分离产生的菌株中分离获得。为了推断出潜在的代谢分布模式，我们需要更多的结构数据。在寻找栖息于红树林（Kandelia candel，木榄和Aegiceras corniculatum）的细菌的天然产物过程中，我们确定了植物源germacranes，腺苷（kandenols），和多种多样的indolosesquiterpene（sespenine，indosespene ，xiamycin及其二聚体）实际上是由细菌产生。

这里我们将叙述源于木榄的内生链霉菌属（JMRC：ST027706）的三种罕见细菌caryolanes类化合物的分离和结构鉴定。 我们将阐述caryolane的晶体结构，同时通过综合的立体化学分析确认细菌萜骨架就是植物来源的 caryolanes的镜像。

结果和讨论

链霉菌JMRC：ST027706从木榄的茎中分离出来。 在与茴香醛—硫酸显色反应之后，其粗提取物的TLC（薄层色谱）分析显示在非极性区域中出现了有趣的斑点。 为了阐明这些不寻常的亲脂性组分，将来自放大培养物（200L）的提取物在Amberchrom 161c树脂LC，硅胶和Sephadex LH-20上进行色谱层析分离，分别得到化合物1（0.5mg），2（7.9mg） 和3（2.8mg）。 通过广泛的NMR和CD分析阐明了1-3（图1）的结构并且通过单晶衍射分析进行确证。

EIMS检测表明化合物1，2和3的分子量分别为236，238和238。 1的1 H-NMR谱显示三个甲基单峰（delta;0.93，0.99，1.10）和其它脂肪族质子信号的信号。其13 C-NMR光谱显示15个碳的信号，包括氧化碳（delta;69.5）和羰基（delta;216.9）。通过COSY，HSQC和HMBC光谱的进一步分析鉴定1为与从植物（Sindora sumatrana）的荚果中分离的代谢物9-oxocaryolan-1-ol （4）相同的三环倍半萜。1所有的NMR数据与植物代谢物的公开数据一致，但是1（ 17°）的旋光度与9-oxocaryolan-1-ol （-62°）的相反。因此，1代表植物衍生的对映异构体9-oxaryaryolan-1-ol，命名为bacaryolane A。CD谱（补充数据）表明弱的正向cotton效应，也支持8R的绝对构型。

在2的1 H-NMR光谱中，三个甲基单峰Me-13（delta;1.07），Me-14（delta;1.20）和Me-15（delta;0.90）与1大体上保持一致。明显的差异是氧化次甲基（H-6，delta;4.04）。根据HSQC和HMBC相关性，醇羟基取代在C-6位上。 根据H-12和H-5 / Me-15，H-6和Me-15以及H-5和Me-13之间的2D NOESY相关性（图1）建立了相对构型。因此，2被确定为第二个新的caryolane，命名为bacaryolane B。

3的1H-NMR和13C-NMR数据与2的非常相似，且2D NMR相关建立了与2相同的平面结构。但是，2D NOESY数据也表明H-6和H-2 / Me-14之间的相关性（图1 ）。我们注意到化合物3可以在CH 2 Cl 2 -CH 3 OH中形成细晶体，并对样品进行单晶衍射分析。其结果（图2）确证了我们的假设以及相对构型。化合物3被确定为1，6-二羟基香豆醇，被认为是从Drymaria diandra分离出来的另一种内生链霉菌属的caryolane 。因此，3被鉴定为bacaryolane B的差向异构体，即bacaryolane C。

从细菌培养物中分离三个caryolane同系物非比寻常，因为具有这种镰孢的萜烯被称为典型的植物代谢物（图3）。Caryolanes是来自各种药用植物精油的成分，例如来自中华传统药物Sinacalia tangutica的9alpha;-hydroxy-1beta;-methoxycaryolanol （5）。除9-oxocaryolan-1-ol（4）外，9-oxoisocaryolan-1-ol （6）在S. sumatrana的荚果中被发现。

最近发现了来自细菌的第一个caryolanes（图4）。 Caryolane-1，7 alpha;-diol 是从Drymaria diandra内生的链霉菌属物种中分离的。除此外，来自灰色链霉菌的隐性倍半萜环化酶的异源表达形成了细菌（ ）-caryolane-1-ol。细菌（ ）-caryolane-1-ol 的NMR数据与合成（-）- caryolane-1-ol几乎相同，并且与bacaryolane A-C的高度相似性。然而，在原始出版物中，结构被错误地解析为具有异芳香烃结构。因此，应将其修订为8a。

研究了一些细菌和植物中典型的caryolanes ，它们似乎是由不同的生物合成途径合成的。所有的caryolanes衍生自E-farnesyl阳离子的环化产物humulyl阳离子。humulyl阳离子进一步环化成caryophyllyl阳离子可能导致不同的立体异构体。在这个阶段，由于通路不同，导致生成不同的caryolanes类化合物（方案1）。虽然植物caryolanes在很早之前就已知，但尚未鉴定出负责caryolan-1-ol 生物合成的酶。然而许多植物beta;-caryophyllene合成基因已经确认，此外，来自Arabidopsis thaliana的代表性分析显示环化酶可以产生（-） - beta;-caryophyllene。可以想象，基于单一植物倾向于产生具有不同骨架的化合物（例如，来自S. sumatrana的荚果的4和6），下游环化是非酶的或通用于各种反应通道的环化酶催化。相比之下，在迄今为止研究中，细菌caryolanes是以具有相同绝对和相对构型的明确的碳骨架为特征。特别令人感兴趣的是，第一个细菌caryolane合酶通过（ ） - beta;-caryophyllene产生典型植物产物的对映体（ ） - caryolan-1-ol。来自植物和细菌的caryolanes具有特殊的立体化学特征，并且可以使用该信息来预测萜烯的实际生产者。在这方面，值得注意的是，最近从植物Cirsium souliei 分离出来的caryolanes可显示典型的细菌内生代谢物基本模式。

内生菌通常在维持宿主植物的适应性方面发挥重要作用，因为它们可以产生对抗植物病原体或草食动物的天然产物.这个概念对于经常参与植物的诱导防御过程的挥发性萜类也可能成立。在草食动物或植物病原体侵袭时，植物可释放含有萜烯的挥发物的混合物，其用作直接防御的化合物或吸引捕食者的天敌。为了测试细菌源caryolanes是否具有抗菌作用，有助于对植物的保护，我们对1-3 进行基于细胞的抗菌和细胞毒性测定。由于只有bacaryolane B对Bacillus subtilis ATCC 6633表现出弱活性，所以caryolanes在植物 - 微生物相互作用中可能不起抗菌的作用。然而，值得注意的是，迄今为止已知的细菌野生型caryolanes生产者（3和7）是内生菌。以前的调查表明，内生菌分泌的代谢物在防御和竞争中起作用，但也可能会与宿主植物进行特异性相互作用和通信。在这方面特别令人感兴趣的是，caryolanes的生物合成前体（E） - beta;-caryophyllene在玉米植物中吸引草食动物的天敌。可以想象，来源于红树林植物中细菌衍生的caryolane代谢物也具有类似的情况。 未来关于植物和它们的内生真菌之间的共生性的研究可以考虑到细菌萜类也可以在多个共生互作中起作用。 总体上，内生真菌的代谢物合成可能有助于宿主防御和其他类型的植物微生物联系。 为此，内生真菌是具有不同生物活性的小分子的多产来源是不足为奇的。

实验部分

一般实验过程。在Bruker Avance III 500MHz或Avance III 600MHz光谱仪上记录 NMR光谱。 在Bruker FT-IR（IFS 55）光谱仪上记录IR光谱。 在Propol数字自动旋光仪（Dr.Wolfgang Kernchen GmbH，Seelze，Germany）上记录旋光度。 通过SSQ 710质谱仪（Finnigan MAT）获得EI光谱。 使用三重四极质谱仪（Quattro；VG Biotech，Cheshire，UK）测量ESIMS数据。 在硅胶60（Merck，0.04-0.063mm，230-400目ASTM）和Sephadex LH-20（Pharmacia）上进行色谱分离。 在硅胶板（Sil G / UV 254，0.20mm，Macherey-Nagel）上进行TLC分析。

菌株分离和分类。2002年6月在中华人民共和国福建省厦门收集木榄的茎，并经中华人民共和国厦门大学彭林教授认证。该植物的凭证样品保藏在北京大学自然和生物仿制药国家研究实验室。 JMRC：ST027706从这个植物的茎中分离。 它被保藏在德国耶拿HKI的菌种收集所。通过GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）16S rDNA的核苷酸序比对（登录号KR703649），与链霉菌属（Streptomyces f lavovirens）和链霉菌（Streptomyces f lavogriseus）分别显示99％和98.3％的相似性。

发酵。将链霉菌属菌丝体和孢子的悬浮液（约1times;1cm）接种到液体有机介质79（葡萄糖10g，细菌蛋白胨10g，酪蛋白氨基酸1g，酵母提取物2g，NaCl 6g，H 2 O 1L）（2times;100mL /瓶）。JMRC：ST027706在琼脂斜面或琼脂平板上生长。 在28℃的旋转振荡器上

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