用代谢组学方法综合分析黄精提取物的降血脂作用外文翻译资料

 2022-12-28 03:12

用代谢组学方法综合分析黄精提取物的降血脂作用

摘要：目的：用整合的非靶向代谢组学的方法探究黄精对血脂异常的大鼠的活性影响和机理。方法：采用高脂饮食（HFD）诱导大鼠血脂异常模型，灌胃给药黄精[4g/（kg·d）]14周。观察各组大鼠血清及肝脏脂质指标的变化。采用超高效液相色谱/质谱法分析血清、尿液和肝脏样品中的代谢物，然后进行多元统计分析，以确定潜在的生物标志物和代谢途径。结果：黄精能显著抑制HFD引起的肝脏和血清中胆固醇和甘油三酯的增长，同样也能显著调节代谢物在分析的样品中接近正常状态。在血清、尿液和肝脏样本中分别鉴定出19个、24个和38个潜在的生物标志物。这些生物标志物涉及苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成，以及色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、淀粉、蔗糖、甘油磷脂、花生四烯酸、亚油酸、烟酸、烟酰胺和鞘脂的代谢。 结论：黄精通过调节血清、尿液和肝脏中的许多内源性代谢物来缓解HFD引起的血脂异常。总的来说，我们的究结果提示黄精可能是治疗血脂异常和相关疾病的一种很有前景的脂质调节剂。

关键词：血脂异常；脂质调节；代谢组学；多元统计分析；黄精；超高效液相色谱/质谱

核心提示：我们采用非靶向代谢组学方法研究了黄精（P.kingianum）对高脂饮食（HFD）诱导的大鼠血脂异常的影响及其作用机制。结果表明，黄精通过调节血清、尿液和肝脏中大量内源性代谢产物，减轻HFD引起的血脂异常。这涉及苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成，以及色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、淀粉、蔗糖、甘油磷脂、花生四烯酸、亚油酸、烟酸、烟酰胺和鞘脂代谢。黄精可能是一种很有前途的脂质调节剂，用于治疗血脂异常，进一步缓解其相关疾病。

引言

血脂异常是代谢综合征的核心特征，是动脉粥样硬化、冠心病、中风等心脑血管疾病的重要危险因素。它还与许多重要疾病如糖尿病和肾病密切相关。血脂异常分为原发性和继发性两种类型。原发性血脂异常通常是家族遗传，也许是由先天性的酶缺乏而引起的。继发性血脂异常通常出现在糖尿病、甲状腺功能减退、肾病综合征、胆道梗阻、胰腺炎、痛风、酒精中毒和各种肝脏疾病的患者中。生活水平的提高和相关生活方式的改变导致血脂异常被认为是全球代谢疾病最重要的危险因素之一。因此，血脂异常的管理对于防治人类各种急慢性疾病具有重要意义。

常用的脂质调节剂包括他汀类药物、贝特类药物、烟酸及其变体、胆汁酸螯合剂和胆固醇吸收抑制剂。这些药物可以有效地治疗血脂异常，但有显著的副作用。例如，他汀类药物可能会增加血糖浓度，导致横纹肌溶解症或损害肝脏和肾脏。中药是世界上最古老的草药之一，几千年来被中医广泛应用。中药在预防和治疗人类疾病，特别是复杂和慢性疾病方面具有不可或缺的作用。中药作为一种副作用比西药少的辅助治疗技术，已被广泛应用于调节脂代谢紊乱。因此，中药可作为开发新型调脂药物或保健品的基础。

黄精最早记载于公元220-450年的《明义别录》（洪景涛著），作为一种中药和营养食品已有2000多年的历史。《中国药典》（2015年版）规定黄精为黄精的合法来源。黄精（P.kingianum；图1）主要分布在中国云南、四川、贵州和广西。它主要由皂苷和多糖组成，具有刺激免疫系统、抗衰老和调节血糖等药理作用。我们前期的研究表明，黄精总皂苷和总多糖具有调节血糖和血脂的作用。然而，黄精的调脂作用及其机制尚不清楚。

代谢组学可以全面表征生物系统中的小分子代谢物。它还可以概述代谢状态和外部刺激后的整体生化事件，如疾病模型和药物治疗后[13]。代谢组学是药理学和药物动力学研究中的一种新方法，越来越多地被用于评估中药和中药方剂的治疗和毒性作用及其作用机制。

在本研究中，我们研究了黄精对高脂饮食（HFD）诱导的大鼠血脂异常的调节作用及其机制。采用了一种基于血清、尿液和肝脏样品超高效液相色谱/质谱（UHPLC/MS）分析的综合非靶向代谢组学方法（图2）。结果表明，黄精通过调节血清、尿液和肝脏中多种内源性代谢产物来减轻HFD引起的血脂异常。综上所述，这些研究结果表明，黄精可能是一种很有前景的脂质调节剂，能治疗血脂异常，进一步缓解相关疾病。

材料与方法

化学品、试剂和材料

用于测定甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）浓度的试剂盒购自中国北京中盛北生物科技有限公司。双肌酸（BCA）蛋白测定试剂盒购自北京生物技术研究所（上海）。辛伐他汀购自杭州默克东方制药有限公司（中国杭州）。HPLC级甲酸和乙腈购自默克公司（德国达姆施塔特）。啮齿动物基础日粮（碳水化合物、蛋白质和脂肪提供的热量分别为62%、26%和12%）来自苏州双狮实验动物饲料科技有限公司（中国苏州）。胆固醇、精制猪油和鸡蛋分别由北京博鳌拓展有限公司（中国北京）、四川绿岛有限公司（中国成都）和沃尔玛超市（中国昆明）供应。使用Milli-Q系统（美国马萨诸塞州贝德福德Millipore）净化高纯度去离子水。所有其他试剂均为分析级或更高级别。2017年4月7日，从文山神农特鲁本药材种植合作会（中国文山）购买了黄精。样品经解宇教授鉴定，凭证标本（8426号）存放于云南中医药大学代谢性疾病防治重点实验室（昆明）

黄精提取物的准备

黄精按《中国药典》（2015年版）规定炮制。简单地说，从须根中分离出新鲜的黄精根茎，洗净，切成厚片，在50℃下干燥。然后将干燥的材料渗透到5倍体积的绍兴黄酒（北京二商王之和食品有限公司，中国北京）中，然后放入蒸汽灭菌器（LDZX-50 KBS，中国上海申安医疗器械厂）在120℃下蒸2.5小时，冷却3小时后，在60℃下干燥。

将蒸制和干燥后的黄精样品粉碎，浸入7倍体积的水中30分钟，然后用水煎煮60分钟。滤液在浸出后收集。用7倍体积的水连续煎煮残渣60分钟，并过滤提取液。然后将两种滤液合并并使用R-210旋转蒸发器（Buuml;chi Labotechnik AG，瑞士富兰克林）在50℃减压下冷凝。最后，使用FD5shy;3冻干机（SIM International Group Co.Ltd.，Newark，DE，United States）将浓缩物冻干成粉末。获得的样品粉末在室温下储存在干燥器中直至使用。

动物实验

健康雄性Spragueshy;Dawley大鼠（200plusmn;50g）来自Dashuo Biotech。有限公司（中国成都）。他们被调整到一个可控的环境（22plusmn;1℃的温度；60%plusmn;10%的湿度；12小时/12小时的光/暗循环），可以自由获得水和商业实验室的完整食物。实验符合美国国立卫生研究院出版的并经云南中医药大学动物护理与实验伦理委员会（Rshy;062016003）（中国昆明）特别批准的实验动物护理与使用指南。所有合理的努力都是为了尽量减少动物的痛苦。

适应性喂养1周后，将大鼠随机分为正常对照组（生理盐水）、模型组（生理盐水）、辛伐他汀[1.8mg/（kgbull;d）]和黄精[4g/（kgbull;d）]组。辛伐他汀组作为阳性对照。给大鼠灌胃给药，每天一次，连续14天周。用生理盐水配备辛伐他汀和黄精。除正常对照组外，其余各组均用HFD（含1%胆固醇、10%精制猪油、10%鸡蛋和79%基础饲料）诱导血脂异常14周。

模型制作

为了收集尿液样本，每个实验组的大鼠在14周治疗的最后三周被安置在代谢笼中。从代谢笼中采集样本，并立即转移到无菌管中。第14周末次给药后，大鼠禁食12小时，然后用水合氯醛麻醉。从肝门静脉采集空腹血，采集肝脏，在-80℃保存直至使用。将血样在4℃下凝固，并在10000 g下离心10分钟，然后收集血清并在shy;80℃下储存，直到测定。

血清和肝脏脂质参数的测定

用100mu;L血清和100mu;L肝匀浆上清液测定TG和TC浓度，其中蛋白浓度用BCA法测定。根据制造商的说明，使用商用诊断试剂盒，在SpectraMax Plus 384微孔板读取器（美国加利福尼亚州桑尼维尔市分子器件公司）上评估所有参数。

UHPLC/MS分析的充分预处理

血清样品：用600mu;L乙腈稀释等分血清（200mu;L）。旋涡混合并在4℃静置20分钟后，样品在12000 rpm和4℃下离心15分钟。收集的上清液在温和的氮气流下干燥。所得残留物重新溶解在100mu;L乙腈中进行代谢组学分析。

尿样：用FD5shy;3冻干机（SIM International Group Co.Ltd.，Newark，DE，United States）将尿样冻干成粉末。用100mu;L乙腈水稀释样品。旋涡混合并在4℃静置20分钟后，样品在12000 rpm和4℃下离心15分钟。收集的上清液用温和的氮气流干燥。残留物重新溶解在100mu;L乙腈中进行代谢组学分析。

肝脏样品：样品在预处理前在室温下解冻。每只大鼠的肝组织（0.2 g）用1.0 mL生理盐水均质，然后用300mu;L乙腈稀释。旋涡混合并在4℃静置20分钟后，样品在12000 rpm和4℃下离心15分钟。收集的上清液用温和的氮气流干燥。残留物重新溶解在100mu;L乙腈中进行代谢组学分析。

UHPC /MS分析条件

UHPC/MS分析在UHPC Dionex Ultimate 3000系统上进行，该系统与带有加热电喷雾电离探针的Thermo Scientific Q-Exactive TM混合四极轨道质谱仪（Thermo Fisher Scientific，San Jose，CA，United States）耦合。uhpc系统由四元泵、具有温度控制功能的自动取样器、柱箱和光电二极管阵列（PDA）探测器组成。

所有样品的UHPLC条件为：（1）色谱柱：热C18柱（100 mmtimes;2.1 mm I.D.，1.9mu;m）；（2）流动相：0.1%甲酸（A）和乙腈（B），梯度程序（0shy;3 min，5%B；3shy;5 min，5%B→23%B；5shy;10 min，23%B→43%B；10shy;13 min，43%B→64%B；13shy;16 min，64%B→85%B；16shy;18 min，85%B）→100%B；18~20min，100%B→100%B）；（3）流速：0.2mL/min；（4）进样量：4mu;L。

所有样品的质谱条件为：（1）流速：0.2mL/min（从UPLC流出物中分离）；（2）检测方式：正、负离子；（3）热阻滞曲线脱溶线温度：250℃；雾化氮气流量：1.5l/min；界面电压：（ ）3.5kv，（-）-2.8kv；（4）质量范围：MS，m/z 100-1000；MS 2和MS 3，m/z 50-1000；（5）动态排除时间：10s；（6）工作站：Xcalibar 3.0.63，用于结合数据处理、分子预测和精确分子量计算的液相色谱。

统计分析

血清和肝脏中的脂质浓度表示为平均值plusmn;标准差（SD）。使用SPSS软件（13.0 for Windows；SPSS，Chicago，IL，United States）进行统计分析。组间差异采用单因素方差分析（ANOVA，Dunnetts method）进行分析。Plt;0.05（双尾）具有统计学意义。

所有UHPC/MS原始文件均以Xcalibur原始文件（.raw）格式导出，并使用Xcalibur 2.0软件（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，United States）转换为可计算文件格式（.cdf）。然后将转换后的文件传输到XCMS online(https://xcmsonline.scripps.edu)包括所有数据组和输出。之后，在SIMCA-P14.1软件（Umetrics，Umearing;，Sweden）上进行多元统计分析，包括主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。根据OPLS-DA投影的可变重要参数（VIPgt;1.0）选择潜在的生物标志物。利用METLIN数据库对代谢物进行了鉴定，并与先前报道的数据进行了比较。最后，通过MetaboAnalyst4.0在线版的京都基因和基因组百科全书（KEGG）发现了涉及已鉴定代谢物的生化反应(http://www.metaboanalyst.ca)。

结果

HDF和黄精对体重和摄食量的影响

在本研究中，使用HFD大鼠模型研究了黄精对HFD介导的血脂异常的潜在影响，该异常是由14周的HFD给药引起的。黄精组在HFD给药过程中，以4g/（kgbull;d）的剂量经口灌胃给药。在实验过程中，没有一只老鼠死亡，它们有着健康的皮毛，正常的饮酒习惯，对外界刺激反应迅速自如。如表1所示，HFD使体重略有增加，但黄精和辛伐他汀对体重和食物摄入量的影响不显著。

黄精对HFD大鼠血清和肝脏脂质的影响

首次在HFD诱导的大鼠血脂异常模型中评估了黄精对血清和肝脏样品中脂质的影响。如表2所示，喂食HFD大鼠14周后，TC浓度显著升高，但对血清TG浓度无显著影响。辛伐他汀可以显著降低这些影响，辛伐他汀可以纠正血脂异常。与辛伐他汀相似，黄精能显著预防HFD引起的血脂异常。此外，表3显示，与正常对照组相比，HFD大鼠喂养14周后，肝脏TC和TG浓度显著升高。然而，这些影响是显着减少

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