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基因表达谱分析确定前列腺癌的临床相关亚型
前列腺癌是癌症死亡的主要原因，表现出从相对惰性到侵袭转移性疾病的广泛临床特征。为了探索潜在的分子变异背后的这种临床异质性，我们使用含有26,000个基因的cDNA微阵列，含有62个原发性前列腺肿瘤以及41个正常前列腺标本和9个淋巴结转移瘤的基因表达。无监督的等级聚类很容易将肿瘤与正常样本区分开来，并且根据不同的基因表达模式进一步确定了前列腺肿瘤的三个亚类。高级和晚期肿瘤以及与复发相关的肿瘤在三种亚型中的两种中不成比例地表现，其中一种也包括大多数淋巴结转移。为了进一步表征肿瘤亚型的临床相关性，我们通过在代表独立的一组225个前列腺肿瘤的组织微阵列上使用免疫组织化学来评估作为替代标志物的两个基因在肿瘤亚群中差异表达的基因。MUC1阳性染色是一种在具有侵袭性临床病理特征的亚组中高表达的基因，与复发风险增加有关（P = 0.003），而AZGP1（一种在另一亚型中高表达的基因） 与复发风险降低相关（P = 0.0008）。 在多变量分析中，MUC1和AZGP1染色是肿瘤复发的有力预测因子，与肿瘤分级，分期和术前前列腺特异性抗原水平无关。我们的研究结果表明根据其基因表达模式可将前列腺肿瘤进行有效的分类，这些肿瘤亚型可为预后改善和治疗分层提供依据。
在全球范围内，前列腺癌是第三大最常见的癌症，并且是男性癌症死亡率的6％[1]。其发病率和死亡率在世界不同地区有所不同，在西方国家最高[2]。在美国，它是诊断最多和男性中癌症死亡的第二主要原因[3]。尽管死亡率很高，但前列腺癌往往是一种懒惰疾病，患者多年来可能无症状。血清前列腺特异性抗原（PSA）筛查的广泛使用已经导致鉴定出越来越多的年轻男性中无症状的低阶段肿瘤[4,5]。一个重要的临床问题已成为是否以及如何积极地治疗这些患有局限性前列腺癌的患者。
目前，诊断时的预后和治疗分层基于临床分期，活检Gleason分级（肿瘤分化的量度）和血清PSA水平。在根治性前列腺切除术治疗的病例中，预后可以通过病理分期和病理分期来确定。然而，这些预后指标并不能准确预测个体患者的临床结果。需要改进的标记物来确定哪些患者可能从更积极的治疗中受益，以及哪些患者可能免于不必要和可能有害的干预。
观察到前列腺癌的异质性异常可能反映出肿瘤之间潜在的分子异质性，尽管在光学显微镜下大部分不可见，但可能通过使用DNA微阵列分析基因表达来捕获。事实上，微阵列分析研究已经在白血病[6,7]，淋巴瘤[8]，乳腺癌[9,10]和肺癌[11-13]中鉴定出临床相关的基因表达亚型。虽然前列腺癌的DNA微阵列研究已经鉴定出与非肿瘤样品[14-18]相比差异表达的基因和表达与肿瘤分级，转移和疾病复发相关的基因[14,17,19,20],迄今为止，基于肿瘤类型的基因表达尚未被识别出。
在这里，我们报告了基于cDNA微阵列的前列腺癌研究，识别出生物学和临床相关的基因表达的肿瘤亚型。此外，我们证明作为肿瘤亚型的替代标记的两个基因的蛋白表达水平，是肿瘤复发的强预测因子，与已知的危险因素无关。我们的研究结果支持在前列腺癌中存在不同的基因表达亚型，以及它们在疾病诊断和管理中的潜在用途。
材料和方法
基因表达谱分析 从斯坦福大学，卡罗林斯卡研究所和约翰斯·霍普金斯大学获得新鲜冷冻的前列腺手术标本，并通过相关中心的机构审查委员会批准（见注释1，其作为PNAS网站上的支持信息发布）。总共，我们选择研究62个原发性前列腺肿瘤（61个腺癌和1个腺样囊性肿瘤），41个匹配的正常前列腺组织（来自前列腺的非癌区）和9个不匹配的（即不同的患者）盆腔淋巴结转移。表2提供了标本详细的病理和临床数据，该数据作为PNAS网站的支持信息发布。基本上如[9]所述通过使用含有26,260种不同人类基因（UniGene聚类）的cDNA微阵列进行基因表达谱分析。更多详细信息，包括数据选择和操作方法，可以在注释2中找到，该注释在PNAS网站上作为支持信息发布。
组织微阵列 使用组织排列器（Beecher Instruments，Sun Prarie，WI）构建前列腺癌组织微阵列，其包含独立的一组225个用于马林固定的，石蜡包埋的原发性前列腺肿瘤病例，其选自斯坦福大学收集的诊断性根治性前列腺切除术标本， 由机构审查委员会批准。重复的0.6mm肿瘤核心代表每种情况，并且该系列与最小临床随访5年和中位随访8年相关。针对MUC1的初级抗体（SC-7313，Santa Cruz Biotechnology）和 AZGP1（SC11242，Santa Cruz Biotechnology）用于免疫组织化学染色。注释3提供了更多详细信息，注释3作为PNAS网站的支持信息发布。
结果
前列腺肿瘤亚型的鉴定 为了调查前列腺肿瘤之间的分子变异，我们通过使用含有26,260个不同基因的cDNA微阵列（参见材料和方法）描绘了112个前列腺组织中的基因表达，包括62个原发性肿瘤，41个匹配的正常前列腺组织和9个不匹配的淋巴结转移瘤。为了探索样本与基因表达的基本特征之间的关系，我们应用了一种无监督的双向等级聚类方法，使用5,153个cDNA，其表达在各样本中表达差异最大（图1a）。总体而言，样本分为两大类（图1b），一个代表肿瘤，另一个，有两个例外，代表正常的前列腺样本。这些例外之一是腺样囊性肿瘤（sample PT153），这是一种罕见的肿瘤，它具有基底上皮细胞的特征[21]，它存在于正常的前列腺中，但在前列腺腺癌中不存在。另一个例外（PT110）可能反映出意外高水平的正常组织污染。尽管与正常前列腺样品相比，肿瘤标本一般具有较高的上皮细胞分数，但肿瘤正常基因表达差异不仅仅反映了不同的上皮细胞含量（参见注释4，其在PNAS网站上作为支持信息发布）。表示在前列腺腺癌中更高表达的基因的表达“特征”（图1k）包括先前描述的AMACR和TACSTD1（18,22,23）以及肿瘤坏死因子受体超家族成员21（ TNFalpha;，TNFRSF21），高尔基磷蛋白2（GOLPH2），净-6和乙酰辅酶A羧化酶alpha;（ACACA），后者与alpha;-甲基酰基辅酶A消旋酶（AMACR）一样参与脂肪酸代谢。这些基因以及此特征中的其他基因可能为改善诊断或治疗提供基础。 较大的基因簇在肿瘤中的表达一直低于正常前列腺样品（部分显示于图1d）。
值得注意的是，无监督聚类也基于不同的基因表达模式将肿瘤样本分成三个主要亚组（图1b）。这些亚型通过使用各种预聚集数据过滤和样本选择标准（图4，其作为PNAS网站上的支持信息发布）来识别，并且也通过主成分分析（图5，其已公开 作为PNAS网站上的支持信息），表明它们代表健全的类别（另见注释5和表格3，它们作为PNAS网站上的支持信息发布）。亚型III包括原发肿瘤以及大部分淋巴结转移，并且相关的基因表达特征（图1g-1）包括与细胞外基质相关的基因（例如COL1A1，COL1A2，CSPG2，SPARC;图1g） ，细胞增殖（例如，TOP2A，E2F1，CDC2，CDC25C;图1h）以及由能量产生（例如ATP5D，DCI，DECR2;图1i）和蛋白质合成（例如RPL13，RPS15，RPS9）。亚型I肿瘤与基因表达的两个特征相关（图1c和f），其中一个（图1f）包括也在正常前列腺上皮中表达的基因，如AZGP1[24]和ARSDR1[25]。亚型II代表最大的肿瘤亚类，除具有特征性基因表达特征（图1e）外，还与肿瘤亚型III共享表达特征（图1j和l）。
图1.前列腺样品的分层聚类分析。（a）112前列腺标本（列）和5,153个变异表达基因（行）的双向等级聚类的缩略图概述。平均中心基因表达比通过log2假彩色标度（比率倍数变化指示）来描述; 灰色表示测量数据不佳。这里描述的完整数据集可以在http://microarray-pubs.stanford.edu/prostateCA上找到。（b）样品树形图的放大视图。正常前列腺样品的末端分支为粉红色，肿瘤样品的末端分支根据基因表达亚组着色：III（紫色），I（黄色）和II（暗蓝色）。两个肿瘤聚类正常样本（设置文本）呈浅蓝色。与个体肿瘤样本相关的临床病理特征由树状图下面的黑框表示（星号表示缺失数据）。高等级表示格里森等级gt; = 4 3; 晚期指示病理阶段gt; = T3; 肿瘤复发表明手术后PSA升高或临床转移。（c-1）从簇中提取的选定基因表达“特征”（由垂直彩条指示的位置）。由于空间的限制，只有选定的基因才被指出。如果与高级（蓝色圆圈），高级阶段（绿色方块），短时间复发（红色三角形）或长时间复发（红色倒三角形）进行监督分析相关联，则基因被注释为所指示的。通过彩色文本（分别为深蓝色和浅蓝色;参见注释1）指示与上皮细胞含量正相关和负相关的基因。以箭头.m表示的特征的基因，用于t检验统计量（等级和阶段）的移动平均（41-基因窗口）图和显示5133个基因的Cox比例风险部分可能性得分（无复发生存） 集群。请注意，峰值（高级别，晚期，早期复发）和低谷通常对应于表征肿瘤亚型的基因表达特征。
图2.与高级别，晚期和肿瘤复发相关的基因。通过使用微阵列（SAM）方法的显着性分析（参见支持注释2）在监督分析中鉴定的基因按其SAM分数的等级值排序; 样本按临床病理参数分组，并按组内的排名值排序。基因表达比通过log2伪彩色标度（指示比率倍数变化）来描述。（a）41个基因（由55个cDNA代表）与高等级呈正相关，FDR为2％; 注意到，在这个FDR上，没有负相关的基因被鉴定出来。（b）与晚期阶段（FDR8％）呈正相关的11个基因（由12个cDNA表示）;在此FDR处，没有负相关基因被鉴定出来。（c）4个基因阳性，19个基因与肿瘤复发的短时间间隔负相关（FDR16％）。橙色条表示与高级（a），晚期（b）或早期肿瘤复发（c）相关的样品和基因。
肿瘤亚型的替代标志物预测复发 为了进一步表征肿瘤亚型的临床相关性，我们通过在包含独立的225个原发性前列腺肿瘤的组织微阵列上使用免疫组织化学来评估两种基因在肿瘤亚型中差异表达的替代标志物，最小临床随访时间为5年，中位随访8年。这两个基因是基于它们在亚型中的差异表达和特异性抗体的可用性来选择的。编码粘蛋白1跨膜蛋白的MUC1存在于表征肿瘤亚型II和III（图1j）的基因表达特征内，两者均与更多“侵袭性”临床病理学特征相关。 通过组织微阵列上的免疫组织化学染色确定的MUC1蛋白表达在整个肿瘤中是可变的（图3a）; 在Kaplan-Meier生存分析中，阳性MUC1染色与显着较短的复发时间相关（P = 0.003;图3c）。相反，编码锌alpha;-2-糖蛋白的AZGP1存在于表征肿瘤I型的特征中（图1f），而且AZGP1的强免疫染色与延长的复发时间相关（P = 0.0008;图3d）。通过结合MUC1和AZGP1上的免疫染色数据（图3e）获得无复发生存曲线中最广泛的分离，表明预后的附加值。
尽管我们注意到肿瘤亚型与肿瘤分级和分期之间存在关联性，但未发现MUC1或AZGP1蛋白表达与肿瘤分级或分期（表6，作为PNAS网站上的支持信息发布）之间的显着关联。为了确定MUC1和AZGP1表达是否与已知的预后因子相比增加了预后信息，我们进行了多变量比例风险分析.MUC1和AZGP1染色被发现是肿瘤复发的强预测因子[比值比= 2.4（1.3-4.2）和0.38（0.21 -0.69）; P lt;0.001]，与肿瘤Gleason分级，分期和术前血清PSA无关（表1）。
讨论
我们研究的主要目的是调查前列腺癌的分子变异，以获得该临床异质性疾病潜在生物学的新见解。我们使用无监督双向分层聚类发现原发性前列腺肿瘤根据基因表达的不同模式分层为三种稳健的亚型。此外，临床病理学特征的分布以及这些亚型上替代免疫组织化学标志物在独立样品组上的表现表明这些亚型与不同的生物学和临床行为有关。
图3.MUC1和AZGP1的表达预测前列腺肿瘤复发。（a和b）前列腺癌组织微阵列的免疫组织化学染色。对于MUC1（a）和AZGP1（b）显示代表性的阳性和阴性染色核。原始的放大倍数是200和400（插图）。（c-e）基于MUC1（c，173可评分病例），AZGP1（d，170可评分病例）或两者（e，160可评分病例）的免疫染色的Kaplan-Meier无复发生存分析。MUC1表达通过阳性与阴性染色进行分层。AZGP1的表达通过强与弱/负染色进行分层。指示了p值（对数秩检验）。
我们已将亚型I肿瘤定性为临床上最不具侵袭性的的亚型。实际上，定义亚型I的两种基因表达特征之一（图1f）包括在正常前列腺中表达的基因，表明该亚组可能代表更高度分化的肿瘤。我们选择AZGP1表达作为该肿瘤亚型的替代标志物，强免疫染色与更长的无复发生存率相关，与肿瘤分级和分期无关。先前已报道AZGP1在原发性前列腺肿瘤中表达，并且在恶性淋巴瘤中表达较少[27,28]。Hale等人 [28]发现与肿瘤分期和分级呈负相关，而Gagnonetal[27]与我们一样没有发现这种关联。鉴于亚组I虽然主要由低级别肿瘤组成，但也包括较高级别的肿瘤，但我们推测表达谱分析可鉴定出组织学不明显的分化标记。
我们已确定亚型III
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