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微量元素铁的含量是厌氧氨氧化和甲烷依赖性脱氮过程之间竞争的关键因素
摘 要
厌氧氨氧化（Anammox）与反硝化厌氧甲烷氧化（DAMO）的耦合是脱氮和减少废水处理过程中甲烷排放的可持续途径。 然而，关于Anammox细菌和DAMO细菌的竞争关系的研究是有限的。 在这里，我们调查了微量元素铁的含量变化对Anammox和DAMO微生物的影响。 短期结果表明，明显刺激Amammox细菌，DAMO细菌和DAMO古细菌活性的最佳铁浓度分别为80,20和80 mM。 随着微量元素铁含量的增加，Amammox细菌的活性比DAMO细菌增加更多。 在培养基中160 mM的高含量微量元素铁长期孵育后，Candidatus Brocadia（Amammox细菌）与Candidatus Methylomrabilis oxyfera（DAMO细菌）和ANME-2d（DAMO古细菌）数量显着增加并且主导了共同培养系统（64.5％）。 同时，随着铁的添加，与对照相比，铵和硝酸盐的去除率分别增加了13.6和9.2倍。 据我们所知，本研究首次探索微量元素铁含量在Anammox细菌与DAMO细菌竞争中的重要作用，并通过调节微量元素铁的含量进一步富集DAMO古细菌。
1.介绍
反硝化厌氧甲烷氧化（DAMO）是一种微生物过程,甲烷在厌氧条件下被氧化以脱氮，Raghoebarsing，Ettwig等人先前证实了一种亚硝酸盐依赖性DAMO细菌，Candidatus Methylomrabilis oxyfera，独立介导的厌氧甲烷氧化耦合亚硝酸盐还原。 此外，属于ANME-2d谱系的依赖硝酸盐的DAMO古细菌，Candi-datus Methanoperedens nitroreducens可以将硝酸盐还原成亚硝酸盐。 其中，当硝酸盐含量有限时，大约10％的亚硝酸盐可被DAMO古细菌进一步还原成铵。
厌氧氨氧化（Anammox）是用于减少废水中氮污染的经济生物过程，已经成功地在大规模实施（Joss等人，2009）。 厌氧氨氧化细菌，如Candidatus Brocadia将铵和亚硝酸盐转化为氮气和约15％的硝酸盐。然而，城市和工业废水中很少出现亚硝酸盐，因此部分硝化过程总是与Anammox（范德尔 Star等人，2007）、铵和溶解的甲烷共存于厌氧消化器流出物中，但目前的处理过程集中于除氮而不是甲烷作为温室气体排放到大气中（Abma等，2010）。 将DAMO与Anammox偶联是限制甲烷排放同时实现脱氮的理想解决方案（Luesken 等，2011）。 硝酸盐是Anammox工艺的副产品，导致不完全的氮去除。 DAMO古细菌可以将这部分硝酸盐还原为亚硝酸盐，DAMO细菌和Anammox细菌可以同时将亚硝酸盐进一步还原成氮气。 DAMO微生物与Anammox配合使用时，主要终产物为二氮气和二氧化碳，理论计量如下：
最近，Anammox，DAMO微生物的共培养物已经通过实验富集Luesken等，2011）。 此外，分子生物学研究已经证明，Anam-mox，DAMO微生物的共培养物还在稻田，湖泊沉积物，林业土壤，湿地等中共存（朱等人，2010; Wang等人， 2012; Yang等人，2012a; 沉等人，2014; Meng等人，2016）。 Anammox细菌和DAMO细菌竞争亚硝酸盐（Luesken等，2011; Hu等人，2015），但迄今为止很少研究竞争的影响因素。
铁是几乎所有微生物生长不可或缺的金属元素（Martin和Fitzwater，1988; 玻璃和玻璃 孤儿，2012）。 它是一些重要蛋白质类别的辅助因子，如血红素，Fe-S蛋白质等（Ayala-Castro等人，2008; 霍普金森等人，2008），是所有器官的基本要素。 此外，已经证实铁显然影响Anammox细菌的代谢（张等人，2012; 赵 等，2014）。 在大多数Anammox系统中，培养基中微量元素铁的含量设定为30mM，基于由Anammox培养基开发的Anammox培养基van de Graaf et al。 （1996）。 尽管如此，关于微量元素铁在DAMO工艺中重要性的研究却很少，随着微量元素铁的进一步添加，DAMO细菌的活性增加。 必须指出的是，DAMO古菌培养物和DAMO细菌培养物中微量元素铁的含量显着不同。 DAMO古细菌的培养基总是含有约40mM铁（Haroon等，2013），而Candidatus Methyltarabilis的培养基含有约3.75mM铁（Ettwig等人，2009）以及早期地球中富含铁的环境可能会导致对古细菌有更多的铁需求。 据我们所知，对DAMO微生物对微量元素铁利用含量差异的调查是有限的。 此外，Anammox，DAMO共培养系统中使用的微量元素铁的含量也是多样化的。 例如，先前的研究分别使用3.75和40mM铁（Shi等人，2013; Ding等人，2014）。 在Anammox，DAMO共培养体系中，这种微量元素铁含量及其效应的显着差异不容忽视。
本研究的目的是：1）阐明Anammox，DAMO共培养体系对微量元素铁含量的影响; 2）确定微量元素铁的最佳含量; 3）探索DAMO古菌的发展; 4）研究微量元素铁对Anammox细菌与DAMO细菌竞争关系的作用。 据我们所知，其他研究很少探索这些目的。 使用含有不同微量元素铁的富含Anammox，DAMO共培养污泥的短期和长期实验。 确定了Anammox细菌，DAMO细菌和DAMO古细菌的活性和群落。
2.材料和方法
2.1.接种和培养基
将含有DAMO古细菌，DAMO细菌和Anammox细菌的中空纤维成员生物膜反应器（HfMBR）用于接种物收集（丁等人，2017）。 HfMBR已经运行了两年多时间，并验证了该项目的参与使用\CH\同位素实验进行厌氧甲烷氧化丁。 当收集接种物时，60.5mg N / L硝酸盐和23.1毫克N / L的铵每日在HfMBR中被除去。 用于后续检查的接种物是homoge-用无机盐培养基（称为常规培养基）在厌氧室中三次混合并冲洗三次。 使用标准方法测定接种物的初始生物质浓度（Rice等，2012），发现约0.15克混合液挥发性悬浮物（MLVSS）/ L。 常规培养基与HfMBR中使用的相同。 常规培养基中微量元素铁的含量根据需要根据添加额外的实验进行调整80mM Fe（II）-EDTA储备溶液。 为了避免沉淀，使用Fe（II）-EDTA储备溶液。 通过鼓泡N2/ CO2（95：5，v / v）除去培养基中的O2，并且培养基的初始pH控制在7.3-7.6。 由于铁被用作微量元素，因此在测试过程中其浓度和状态变化可以忽略不计。
2.2.短期实验
首先，用CH4/ CO2（95：5，v / v）或N2/ CO2（95：5， v / v）15分钟，立即用丁基橡胶塞密封。 随后，将10mL经洗涤的接种物加入每个小瓶中，并且Anammox，DAMO培养物的初始生物质浓度为0.03g VSS / L。 微量元素铁含量对有或无Anammox细菌的DAMO细菌，Anammox细菌和DAMO微生物的短期影响分别进行了评估（表格1）。 每种氮源的消耗率反映了DAMO细菌，Anammox细菌和DAMO古细菌的活性。 为了测量DAMO细菌活性，仅将NO2-N储备溶液添加到CH4-填充的小瓶中。
表格1 在短期实验中使用不同的氮气和顶空气体条件来确定微量元素铁含量的影响。
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NH\ |
NO\ |
NO\ |
CH\ |
N2 |
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Anammox细菌 |
✓ |
✓ |
✓ |
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DAMO细菌 |
✓ |
✓ |
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DAMO细菌 DAMO古细菌 |
✓ |
✓ |
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Anammox细菌 DAMO细菌 DAMO古细菌 |
✓ |
✓ |
✓ |
测量Anammox细菌活性，将NO2--N和NH4 -N储备溶液添加到N2填充的小瓶中。 为了用Anammox细菌测量DAMO微生物的活性，将NO2--N和NH4 -N储备溶液加入CH4填充的小瓶中。 为了测量没有Anammox细菌的DAMO微生物的活性，将NO2--N仅添加到CH4填充的小瓶中。 NO2--N和NH4 -N的初始浓度均为15 mg N / L。 随后，将不同体积的Fe（II）-EDTA原液添加到小瓶中，并且建立下列微量元素铁梯度（mM）：3.75（常规培养基），20,40,80和160.所有实验一式两份进行。 有迹象显示氮浓度较低时氮的去除速率会减慢（Ettwig等，2016）。 因此，通过氮源浓度高于5mg N / L的线性回归获得了氮去除率。 将每个实验的最大亚硝酸盐浓度作为亚硝酸盐积累值。 所有的短期实验都在同一时间进行，并在两天内完成。
2.3. 长期实验
对于Anammox，DAMO共培养系统的微量元素铁含量的长期评估，根据短期实验的结果设计了225天的孵化实验。 因此，使用两个450毫升的瓶子和150毫升的顶空。 对照常规培养基中微量元素铁的含量为3.75mM。 相反，实验组常规培养基中微量元素铁的含量分别在第1-25,26-69,70-102,126-146和14-225天分别为20,40,80,160和80mM。 通过添加相应的浓缩溶液，在每个循环中 NO2--N和NH4 -N的初始浓度都保持在100mg N / L。 当NO2--N浓度达到10 mg N / L以下时，将一半沉降培养基更新并用CH4/ CO4（95：5，v / v）喷射15分钟，确保营养元素供应给微生物。 硝酸盐和铵的转化率反映了Anammox，DAMO共培养系统的活性。
2.4.分析方法
经过238天的长期实验，从对照和实验组收集用于DNA提取的微生物样品（10mL）。 在我们以前的工作中描述了DNA提取和随后的定量聚合酶链式反应（qPCR）的详细方法（Fu等人，2015).
通过引物PS5（341b4F-806R）扩增16S rRNA基因。 Novogene（中国北京）提供高通量测序和分析,详细的方法已经提出。Lu等人 （2015）.
通过0.22-mm旋转过滤器过滤后，Aquakem 200-水质自动分析仪（Thermo Fisher Scientific，Vantaa，芬兰）分析培养基中含氮化合物的浓度。
3.结果
3.1. 短期实验
3.1.1. DAMO细菌和Anammox细菌不同浓度的微量元素铁
在短期实验中微量元素铁含量对DAMO细菌和Anammox细菌的影响显示在图。1。 随着铁浓度从常规培养基中初始水平（3.75mM）增加到20mM，DAMO细菌的活性增强，并且在浓度高于20mM时稍微降低。 最高活性为0.081plusmn;0.006mg N / mg VSS · h，并且在铁浓度为20mM时指出。 当铁浓度梯度从初始水平增加到80mM时，Anammox细菌的活性增加，而当铁浓度达到160mM时，Anammox细菌的活性降低。 最高活性为0.158plusmn;0.013mg N / mg VSS · h，并且在铁浓度为80mM时观察到。 虽然DAMO细菌和Anammox细菌的活性分别在铁浓度高于20和80 mM时下降，但仍高于常规培养基中的活性，表明微量元素铁的含量对DAMO细菌没有明显的抑制作用， Anammox细菌在测试中。 此外，Anammox细菌活性的提高比DAMO细菌的活性更明显。 虽然Anammox细菌活性稍低于常规培养基中的DAMO细菌活性，但当铁浓度增加至20mM时其增加。 铁浓度的进一步增加导致Anammox细菌活性的显着增加。 与DAMO细菌相比，当Anammox细菌的亚硝酸盐转化率增加2.9倍时，DAMO细菌和Anammox细菌在铁浓度为80mM时表现出最大的差异。
3.1.2
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