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关于高折射率液体浸微球的光学超分辨率的研究
摘要：实验表明，直径（D）在2–220 lm范围内且具有高折射率（n ~ 1.9–2.1）的钛酸钡玻璃微球可用于液浸纳米结构的超分辨率成像，使用微米级微球，我们展示了分辨图案形状的能力，最小特征尺寸为〜lambda;/ 7，其中lambda;是照射波长。 对于Dgt; 50 lm的球，发现可分辨的特征尺寸增加到〜lambda;/ 4。在此给出了有关分辨率，放大倍率和视野的详细数据。 这种成像技术可用于生物医学显微镜，微流体技术和纳米光子学应用。
近几年来，对人造材料和结构特性的研究发展已经使成像系统的光学分辨率有了飞跃性的提高，远远超出了光学经典衍射极限。理想的成像设备应该能够捕捉到物体的亚衍射极限细节，并以一定的放大率将其投射到远场中。目前超分辨率成像设备可以通过使用固体浸没透镜，近场探头，荧光，非线性和负折射率材料，等离激元光栅和双曲线超材料实现，但是，应注意的是，这些结构和设备的应用由于其复杂的工程设计和各种技术限制而在一定程度上受到阻碍。
在这种情况下，使用纳米透镜，微滴，以及微球的近场显微镜作为获得光学超分辨率的出乎意料的简易方法出现了。已经证明，折射率 (n) 约为1.46且直径 (D) 在2-9 lm范围内的硅球可以将隐失场中的高频空间频率转换成传播模式，通过“穿过微球”观察结构表面下方的微球产生的虚像可用于远场成像，从而获得其亚衍射极限特征。最近研究表明，可以通过将相应的低折射率微球半浸入液滴中来增强该技术的超分辨能力，从而以相对较小的放大倍数获得更加高的对比度。但是应当了解的是，对于生物医学领域中的应用，尽管半浸没式的微球成像是有一定作用的，实际应用中却会由于液体的蒸发导致光学装置的分辨率以及放大率出现一个动态的变化，因此使用半浸入式的微球成像在实际应用的技术中就变得较为复杂。目前，有人提出了当微球完全被液体层浸没时，这种完全浸没式的微球成像没有办法获得超分辨的效果。
有人提出，在基本层面上，微米级球体的超分辨率强度与它们将光聚焦到亚衍射有限维度的能力之间存在联系。这种紧密聚焦的光束被称为“光子纳米射流”和相应的“纳米射流诱导模式”，它们分别在单球和球链中被观察到。通过这个理论计算预测了最大超分辨强度应在n = 1.8时出现。因此有人认为，对于ngt; 1.8，超分辨率强度应该随着微米级球体直径范围的减小而减小。
在这项研究中，我们通过实验证明，如果微球的折射率高于1.9，是可以通过完全浸入液体的方式进行微球成像从而实现超分辨成像的。最近，具有n 约1.9-2.1的钛酸钡玻璃(BTG)微球已经在水环境中进行了光学表征，在这里，通过使用浸入折射率为1.37的异丙醇（IPA）中的微米级BTG微球，我们证明了辨别小至约lambda;/ 7的特征的能力，其中lambda;= 550 nm是峰值照明波长。在图1(a)和1(b)中分别示出了设置和虚拟图像形成的示意图，对于50 lt;D lt;200 lm的球，发现可识别的特征尺寸增加到约lambda;/ 4，超分辨率视场（FOV）随着D达到约200 lm球面的超大值（约30 lm）而线性增加，对于D在2–220 lm范围内的微球，虚拟图像的放大倍率在2.5–4.5范围内。
如图所示，图1(c)和图1(f)分别研究了包含点和线对象的两种样本，具有点对象的样品（图1(c)）由金纳米粒子二聚体（NPD）的二维阵列分别在x和y方向上具有320 nm和800 nm的周期表示。每个二聚体由两个直径为120 nm，高度为30 nm的金纳米圆柱体（2 nm Cr和28 nm Au）组成，它们是通过电子束光刻，金属蒸发和剥离工艺在熔融石英基板上制成的，在不同阵列中，二聚体中最小的边对边间隔为120和150 nm。图1(c)中的SEM图像代表具有150 nm间隔（沿y方向）的NPD。如图1（f）所示，使用市售蓝光光盘（BD）可获得标称轨道间距为300 nm的线性物体样品，该间距由200 nm宽度的条带和100 nm宽度的凹槽分隔开。在放置微球之前，先剥离100 lm厚的圆盘透明保护层，NPDs样品是在BU制造的，而成像技术的开发是在UNCC进行的。
在实验中使用了BTG微球（Mo-Sci Corp.）的两种种类，它们的化学组成不同，因此其折射率也不同（n约为1.9和约为2.1），然后使用微操作或自组装将微球定位在样品上，其后用微注射器将IPA倒在样品表面上，以完全覆盖微球，水渗入也可以完成类似的条件。
在实验中还配备了卤素灯和CCD相机的FS70三丰显微镜在反射照明模式下使用100倍（NA = 0.9）或20倍（NA = 0.4）显微镜物镜。系统光谱响应在550 nm处达到峰值，使用额外的滤光片，我们在以550纳米为中心的窄频带(约20纳米带宽)照明下，验证了所有结果的重复性。传统显微镜只能分辨NPD阵列最大的800纳米周期(沿y方向)，如图1(d)所示，这是由于微球外的条纹图案。在这幅图中，无论是320 nm的周期，还是NPDs中150 nm的边到边的分离都没有被解决，BD中的100纳米特性也无法解决。
在研究当中，我们观察到，没有液体的BD的超分辨率成像可以使用折射率较小到中等的微球来实现，如硼硅酸盐玻璃(n约为 1.47)、钠钙玻璃(约为1.51)、聚苯乙烯(约为1.59)和蓝宝石(约为1.77)，但是，如果所有这些微球都被IPA等液体完全覆盖，则会发现它们完全失去了成像能力。
在相同实验中，高折射率（n约为1.9-2.1）的BTG球则表现出不同的结果，没有添加液体，它们不会产生任何成像，然而，当它们完全被液体覆盖时，它们提供了超分辨率的成像，如图1(e)和图1(h)所示的点和线性物体。与图1(d)和图1(g)中相同结构的常规图像相比，这些图像的聚焦深度低于结构表面，从图1(e)中可以看出，直径为120 nm、分离距离为150 nm的单个金纳米颗粒的远场虚拟图像得到了解决。如图1（h）所示，对于BD可以看到类似的分辨率，这些结果显示了以最小特征尺寸约为lambda;/ 4识别图案形状的能力，但是，由于有限的物体尺寸，直接应用Rayleigh准则很复杂。而成像应用的一个重要特性与FOV有关，在以前的研究中，由于低折射率球体的直径较小，FOV被限制在几微米范围内，我们发现，高折射率液体浸没球体在相当大的直径下仍能保持其超分辨能力。如图2(a)和图2(b)所示，对于n约为1.9和D约为125 lm的球体，NPD阵列中的150 nm分色是通过一个非常大的(约为22 lm) FOV来解决的。将n 约为 2.1和D 约为 53 lm完全浸泡在IPA中，BD样品也得到了类似的结果，如图2(c)和图2(d)所示。
完全浸没式的微球的超分辨强度取决于两个因素。首先，对于尺寸参数为q =pi;D/lambda;≫ 100的足够大的球体，可以通过减少液体的lambda;来提高分辨率，其方式类似于在液浸式透镜系统中发生的方式，其次，对于较小的尺寸参数值（q lt;100），由于中尺度球体的“光子纳米射流”特性，可以进一步增强超分辨率强度。当折射率反差足够大时，消失场在接近球面的场分布中起着重要的作用;然而，近场倏逝波在超分辨率成像机制中的作用有待进一步研究。
为了研究分辨率与D的之间存在的关系，我们使用了图3(a)中所示的120nm最小间距的NPD阵列，如图3(b) -3 (d)所示，分辨率一般随D的增加而降低，强度分布沿连接两个纳米颗粒的轴线进行了测量，并进行了120nm的分离，如图3(b) -3 (d)所示，他们显示双峰结构，拟合使用两个高斯峰，图3(b) -3 (d)中的虚线(红色)曲线表示高斯峰的和。4.2 lm球体,最小可识别的特征尺寸约为 75 nm(约为lambda;/ 7)可以估计时,假设两个同样强烈的点是解决它们之间的强度是0.81。对于D = 53 lm球体,相同的标准会导致明显的特征尺寸最小约为lambda;/ 4.5。并且，通过在相机前插入一个线性偏振器，研究偏振效应对BD样品图像的影响，如果偏振器轴平行于BD条纹，则图像的对比度最小，如图4(a)所示。如图4（c）所示，在垂直于BD条纹的偏振器轴上实现了图像的最大对比度。
为了研究图像放大(M)，我们使用了n约为1.9和2 lt; D lt; 220 lm的微球，如图5(a)所示。
折射定律由折射率对比确定，nrsquo; = n / n1〜1.39，对于位于球体表面的物体，虚像放大倍率可以估算为| M |〜| nrsquo; /（2- nrsquo;）|〜2.3。对于D ~ 220lm的微球，几何光学被认为是一个合理的近似，我们测量了M ~ 2.5。对于不适用几何射线追踪的最小微球，2 lt; D lt; 6lm，我们观察到M随着微球直径的增大而增大，这与以往空气中低折射率微球成像的研究相似。在中间直径范围6 lt; D lt; 10 lm，我们发现M在3.5-4.5范围内，随着球体的显著变化而达到最大值，如图5(a)所示，值得注意的是，M的测量由于难以在虚拟图像上再现相同的聚焦深度而变得复杂。此外，由于枕形畸变，图像放大倍率随着距光轴距离的增加而增加，如图1（e）和图5（b）所示，这是由于：没有穿过图像中心的纳米粒子向内弯曲，朝向图像中心。为了减小针垫效应的作用，我们在图像的中心部分确定了M。如图5(b)所示，FOV被定义为样品表面上的圆的直径，在此我们能够识别带有150 nm分色的NPD阵列的形状，FOV与D的线性线性关系如图5(b)所示。
微球透镜投影成像已经成为实现远场超分辨率的令人惊喜的简便方法，目前已经观察到微球的许多相关光学特性，例如光子纳米射流，纳米射流诱导的模式和周期性聚焦的模式，从而刺激了这些结构在聚光设备中的应用。微球在生物医学显微镜中的应用通常需要将样品浸液，这大大降低了成像系统的折射率对比度，并降低了其超分辨能力。 在这项工作中，我们通过在液体环境中使用高折射率微球解决了这个问题。对于直径约为几微米的BTG微球（n〜1.9–2.1），我们证明了能够识别最小特征尺寸〜lambda;/ 7的图案形状，对于50 lt;D lt;220 lm的较大微球，发现可分辨的特征尺寸增加到〜lambda;/ 4。并且，我们观察到，对于D gt; 200 lm，随着D达到非常大的值(gt;30 lm)，超分辨率FOV线性增加。该性能降低了对微球精确定位的要求，可以使用由各种高折射率材料（例如二氧化钛或半导体）制成的球体来实现这些方法，根据不同的应用，这些结构可以被水或聚合物材料浸没，由于其简单性，高折射率微球的超分辨率成像可以在生物医学显微镜，微流控设备和纳米光子学中找到许多应用。
作者在此感谢M. A. Fiddy，I.Vitebskiy，V.Kovanis和D. M. Whittaker的讨论，感谢A. D. Davies的共享高NA显微镜物镜，以及MOSCI Corporation捐赠了一些用于这项工作的微球，这项研究由美国陆军研究办公室（ARO）通过合同号为W911NF-09-1-0450的J. T. Prater博士和美国国家科学基金会（NSF）根据项目号ECCS-0824067进行了支持。制造工作由美国陆军Natick士兵中心根据合同号提供支持。W911NF-07-D-001和SMART奖学金项目，并已被批准公开发布NSRDEC PAO#U12-307。
对微球辅助超分辨率成像技术优于固体浸没透镜和共焦显微镜的优势的研究
摘要：在本次研究中，我们证明了微球辅助成像优于共焦和固体浸没透镜显微镜的一系列优点，包括固有的灵活性，更好的分辨率，更高的放大倍率和更长的工作距离，在照明波长lambda;= 405 nm的情况下，在纳米等离子体阵列中发现了约50-60 nm的最小特征尺寸。研究结果表明，与在空气环境中获得相同指数对比度的球体相比，液体浸没的高折射率球体(n ~ 1.9-2.1)具有更好的成像质量。我们估计，在〜200 nm的深紫外波长下使用透明微球可能使具有〜30 nm高分辨率的各种纳米结构成像成为可能。
分辨率优于衍射极限的显微镜将对从细胞成像到半导体器件检查的许多跨学科领域产生深远影响。从根本上讲，这种成像需要通过光学系统收集物体的近场。 近年来，使用近场探头，超振荡透镜，荧光，非线性，负折射率材料和等离激元光栅已经证明了这种成像的主要可能性,但是，由于设计复杂，光谱带宽窄和光通量有限，这些技术尚未得到广泛应用。
应当注意，在更传统的衍射极限共焦和固体浸没透镜（SIL）显微镜中，已经实现了图像质量和分辨率的一些改进。根据Abbe，Rayleigh，Sparrow的说法，在远场光学中，如果圆孔的情况下两个点源之间的距离dge;Klambda;/ NA，则可以解析强度相同的两个点源，其中K = 0.5、0.61、0.473和0.515 ，和休斯顿标准，分别是lambda;是非相干照明的自由空间波长。在SIL技术中，由于成像系统的数值孔径增加而提高了分辨率，NA = n0times;sintheta;，其中n0是物镜空间折射率，theta;是物镜接收锥的半角，还已经证明，通过使用微米和纳米SIL可以超过衍射极限，然而，这种微透镜难以制造并且在所研究结构的表面上具有固定位置。
最近，通过引入介电微球的超分辨率成像，该领域得到了发展，有人提出，这种球体的超分辨率能力源自其非凡的锐利聚焦特性，即所谓的“光子纳米射流”，与SIL相比，微球可以放置得更靠近被研究表面，因为它们的接触区域更小，另外，可以将它们操纵到表面上的所需位置。 最初，这项技术是针对n〜1.46且直径D〜2–9 lm的二氧化硅球而开发的。有人认为，使用高折射率球体（ngt; 1.8）以及将球体完全浸没在液体介质中不适合微球辅助成像。然而，最近的研究表明，高折射率（n〜1.9-2.1）和总液体浸没这两个因素的组合实际上可以增强成像，而分辨出的最小特征尺寸约为〜lambda;/ 7。
由于超分辨率显微镜在生命科学和纳米光子学中的应用，有必要将微球辅助成像的性能与其他已建立的显微镜方法进行比较。尽管以前已经进行了这样的尝试，但是由于各种实验因素，使得这种比较变得复杂。在这项研究中，我们证明与通过共
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