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评估湖泊生态系统水样中的遗传毒素对环境/人身健康的潜在风险：以希腊西部的湖泊为例
Dimitris Vlastos a, Stefanos Dailianis b, Aggeliki Kindou a, Maria Antonopoulou a,Areti Gianni a, Ierotheos Zacharias a
a Department of Environmental and Natural Resources Management, University of Patras, 30100, Agrinio, Greece
b Department of Biology, Section of Animal Biology, School of Natural Sciences, University of Patras, 26500, Patras, Greece
亮点：
1.对希腊西部5个湖泊的水质进行了评估。
2.采用CBMN法对遗传毒物的存在及其对人类健康的风险进行分析。
3.5个湖泊的水样对培养的人淋巴细胞具有遗传毒性。
4.受研究的湖泊中遗传毒素的存在会增加湖泊的对人类健康造成的风险。
文章信息摘要
文章历史：
2016年7月20日收稿
2016年9月4日收到的订正表格
2016年9月6日接受
2016年10月14日发表
编辑r: D. Barcelo
关键字:
基因毒性
物理化学参数
微核试验
湖泊
概念
湖泊是主要的淡水资源，对人类和生态系统都起着至关重要的作用。 基于国际社会对遗传毒性化合物污染水资源兴趣的增加, 本研究目的在于评估从五(5)个湖泊采集的地表水样本的遗传毒性潜力。(Amvrakia, Lysimachia, Ozeros, Trichonida, Kastraki)位于艾托洛阿卡尼亚地区 (希腊西部).
采用胞质分裂阻滞微核(CBMN)法对培养的人淋巴细胞进行遗传毒性评价。 前者以1%、2%和5%浓度的来自每个湖泊的地表水处理淋巴细胞。 在所有研究湖泊中，5%(v/v)剂量时，MN频率增加1.7至3.3倍，差异有统计学意义。在剂量为2%(v/v)的情况下，所有研究湖泊的MN频率增加1.7至2.6倍，差异有统计学意义除了Trichonida湖. 最后，在剂量为1%(v/v)时，差异有统计学意义(2.3倍和2.5倍Ozeros和Lysimachia湖的MN频率相对于对照)。对湖泊地表水样品的潜在遗传毒性效应进行了评价，并对其理化参数进行了分析。我们评估水质的第一步是研究湖泊生态系统中的遗传毒物的存在及其对环境、人类的危险性。本研究首次发现湖泊表层水中存在遗传毒性物质。
- 介绍
湖泊系统是主要的淡水资源，因此它对人类和生态系统都起着至关重要的作用。 鉴于湖泊的地表水在世界各地通常被用作饮用水的来源，以及用于农业和娱乐活动,它们的污染正在成为世界范围内的一个主要问题。由于它们的污染和伴随着食物对动植物以及人类的有害影响的增强，供水(Ohe等人)2004年；欧洲经济区，2011年、2015年)。在欧洲，据报有50万个湖泊，其中大多数(约80%-90%)较小(表面积在0.01至0.1平方公里之间)。近16 000个湖泊的表面积超过1平方公里(克里斯滕森和欧洲环境署(EEA，2015)报告称，其地表水受到广泛的严重污染。人为化学品和危险物质的范围， 主要来源于工业、农业、生活来源和城市污水处理厂，以及地表径流和大气沉积(White and Rasmussen, 1998; Ohe et al., 2004;Konstantinou et al., 2006; Zegura et al., 2009)。
虽然逐步减少危险物质，以及制定优先物质的环境质量标准，进入地表水是当务之急(WFD；第2000/60/EC号指令；第2013/39/EU号指令；欧洲联盟公报，2013年)，为评估水生生态系统中是否存在危险物质或优先污染物而例行进行的水样物理化学分析并不是一个可靠的水质评估工具。事实上，存在于自然水域混合物中的化学物质的添加剂、协同作用或拮抗效应并不总是明确的，由于大部分这些物质在地表水中的含量很低，甚至很难确定(Polack等人，2003年)，这一事实可能低估了所观察到的有害物质u的有害影响。 Pon淡水(包括湖泊)生物群(Csillik等人，2000年；Isosaari等人，2006年；Quiroz等人，2010年；Charalampous等人，2015年)。例如，Helma等人(1998年)指出，化学物质的不良影响，由于存在于复杂的环境样品中，由于在预测其协同和拮抗效应方面的局限性，无法依赖化学表征。在这方面，强烈建议使用生物分析来综合污染物的添加剂、协同作用和拮抗效应(Zegura等人)。2009年；Tsarpali等人。2012年；Defu等人，2 015;Charalampous et al., 2015). 其中，细胞分裂阻滞微核(CBMN)试验等体外致突变性/遗传毒性试验也应纳入水质评价中，以便有效地估计t值。 他在地表水中存在遗传毒性物质(Pellacani等人，2006年；Charalampous等人，2015年；Wernersson等人，2015年)，但不一定事先对水进行了物理化学表征。 r samples (Jha, 1998; Ohe et al., 2004;Ginebreda et al., 2014).
尽管许多与调查地表水样品的遗传毒性和细胞毒性效应有关的研究大多是在植物细胞中进行的(Grant等人，1992年；Ma等人，1995年；K。 ng et al., 1998; Cotelle et al., 1999; Unyayar et al., 2006; Pellacani et al., 2006; Liu et al., 2013; Li et al., 2014), 由于动物细胞和植物细胞之间的明显差异，将其外推到人身上有几个局限性。在此背景下，cbmn试验代表了一种简单、快速和敏感的遗传毒性筛选方法，可用于评估不同类型化学物质及其abi的风险。 在人类中造成遗传损害和致癌过程(Bonassi等人，2011年；经合组织，2014年)。CBMN分析检测了在目前被测试的化学品暴露后细胞分裂后的化学物质潜在的碎裂性和非整性活动(经合组织，2014年)。考虑到(A)水中的基因毒物(致突变性和致癌性化合物)可通过不同的机制造成遗传损伤，(B)体外试验的使用越来越多。 强烈推荐使用cbmn检测作为一种可接受的实验工具，以评估fre中污染物的遗传毒性效应。 水样(Connon等人，2012年；Charalampous等人，2015年；Wernersson等人，2015年；han等人，2016年；Simonyan等人，2016年)，本研究首次对遗传毒性po进行了评估 用CBMN法从位于艾托洛卡纳尼亚地区单位(希腊西部)的五(5)个湖泊采集人体细胞(培养的人淋巴细胞)中的地表水样本 。评估潜在的遗传毒性效应以及分析湖泊地表水样品的物理化学参数是我们评价水质的第一步。 在所研究的湖泊生态系统中，遗传毒物的存在及其对环境/人类的风险。
2。材料和方法
2.1.对研究领域的说明
本研究涉及五个湖泊生态系统：位于希腊西部的四个天然湖泊(Amvrakia、Lysimachia、Ozeros、Trichonida)和一个人工湖泊(Kastraki水库)(图1)。T型 这些淡水环境的主要特征见表1，详细情况载于支持材料Fiile(SM 2.1)。
2.2.水样采集
2014年10月，从每个湖泊的5个不同取样点(深度0-0.5米；从每个点源采集的近5升水)收集了水样(图1)。建立抽样 水质监测站被认为是评价水质的有代表性的站，尽可能接近文献中为比较我们的测量而报道的那些(Overbeck等人，1982年)。 ; Koussouris et al., 1993; Psilovikos et al., 1995; Tafas et al., 1997; Doulka, 2010; Chalkia.等人，2012年；Chalkia和Kehayias，2013年a，b；Thomatou等人，2013年a.每个湖泊的所有样品都被汇集起来，并立即转移到实验室，由Whatmann GD/X纤维过滤器(0.25毫米安)过滤。 D0.2mu;m孔径)，去除溶解颗粒(如粉尘、寄生虫、细菌、病毒)，并在minus;80°C灭菌瓶中进一步保存，进行进一步分析。
2.3.地表水样品的物理化学分析
pH、电导率(CORD)、盐度(SAL)和总溶解固体(TDS)的估算是用HQ 40型多米计进行的(Hach Lange GmbH，德国)。CH的测定 minus;-N和NO2-minus;-N、氨氮(NH4-N)、氯化物(Cl-minus;)、总悬浮固体(Tss)和挥发性悬浮物(Tss)。 根据水和废水检验标准方法(Clesceri等人，1999年)测量ED固体(VSS)。用氧测定生化需氧量(BOD 5)。 Oxitop测量系统采用WTW给出的方法。总氮(TN)采用过硫酸盐法测定(Dlsquo;Elia等人，1977年)。每个采样器湖的所有测量一式三份。
2.4.遗传毒性和细胞毒性对人淋巴细胞培养的影响(CBMN法)
2.4.1.伦理陈述
使用人淋巴细胞的CBMN试验得到了Patras大学伦理委员会的批准(参考文献)。编号：19686/27-05-2015)。特别是在知情同意之后， 健康的、不吸烟的男性个体(20岁和25岁)作为献血者，建立全血淋巴细胞培养体系。根据捐献者的声明，他们没有接触到拉迪。 在最近的过去，药物治疗或任何病毒感染。
2.4.2.实验程序
CBMN测定是根据标准程序进行的(Kirsch-Volders等人，2003年；Corvi等人，2008年；经合组织，2014年)，但略有修改。白翅蝇，取人血液样本。 两名非吸烟者(20岁和25岁)不接受任何药物治疗，病毒感染或X光照射超过一年。将全血(0.5mL)添加到6.5mL火腿F-10m。 Ed，1.5mL胎牛血清和0.3mL植物血凝素刺激细胞分裂。为每个捐献者建立了两种独立的培养(共4种独立培养)。地表水山姆 在培养24h后，以1%、2%和5%的浓度(8.8mL)加入PLES。培养44h后，细胞松弛素B(Cyt-B)最终形成。 在培养物中加入6mu;g mLminus;1)，阻断分裂细胞的胞质分裂。在37℃、5%CO2的加湿气氛中培养72h，然后进行细胞培养。 离心收集。在室温下，用3：1的Hamlsquo;s培养基和Milli-QH2O溶液进行轻度低渗处理，然后固定10 min。 (至少3次)用新鲜的5：1甲醇/醋酸溶液。如最近所述，7%Giemsa对细胞进行了10分钟的染色(Vlastos等人，2010年)。至少4000个双核(BN)细胞w 每个样本对保存的细胞质进行评分，以根据标准计算MN频率(fenech，1997；ferech等人，2003年)。
细胞分裂阻滞增殖指数(CBPI)是通过统计每个样本至少2000个细胞(每个供体每培养1000个细胞)来评估的，如前所述(Surralleacute;s)。 等人，1995年a)。CBPI是由等式给出的。(1)
其中M1、M2、M3和M4分别对应一核、二核、三核和四核的细胞数，而NT和NC分别为处理细胞和对照细胞的总数。2.5.统计分析
所有结果均表示为平均plusmn;标准差(SD)，与每个样品中每个化学参数的3个独立测量值相比，均为标准差(SD)。用Mann Whitney U对Mn数据进行了分析。 测试一下。统计决策基于0.05的显着性水平。用于数据分析的统计软件是用于Windows的统计软件包(SPSS)。
3果和讨论
3.1.湖泊地表水样品的理化分析
物理化学参数的测量结果见表2。根据这些资料，整个五大生态系统的地表水具有碱性的特征。 pH值在7.8~8.3之间。碱性pH值被认为是高光合活性的特征指标，主要发生在暖期。 在过去的几个研究中，自然湖泊是研究的主题，而我们对Kastraki水库的了解是有限的(详见SM 3.1)(表3)。
3.2.遗传毒性和细胞毒性对人淋巴细胞的影响
在本研究中，如前所述，研究了来自五个湖泊的地表水样本，以确定遗传毒物的潜在存在性。采自东非共同体的地表水样本 用3种不同浓度(1%、2%和5%v/v)对H湖进行检测，以确定其对人淋巴细胞的遗传毒性和细胞毒性作用。MN和CBPI肛门检查结果 用不同浓度的地表水处理的人外周血淋巴细胞培养得到的MN诱导平均值和CBPI指数。
在所有研究湖泊中，5%(v/v)剂量组MN频率增加1.7~3.3倍，差异有统计学意义。剂量为2%(v/v)的统计意义 5种差异(MN频率增加1.7~2.6倍于对照)在所有研究湖泊中观察到，除三角湖外。最后，在1%(v/v)的剂量下，有统计学意义的d。 Ozeros和Lysimachialake的MN频率比对照增加了2.3倍和2.5倍(图2)。 Eros和Lysimachia湖在所有测试浓度下都具有遗传毒性，而Amvrakia和Kastraki湖的地表水样品在测试浓度为2%和5%(v/v)时具有遗传毒性。 考虑到被检查的湖泊被农田包围，这可能是农药污染的来源，因此在Amvrakialak中观察到的遗传毒性 E可能与Thomatou等人的发现有关。(2013 B)也报告了阿姆伐克中甲草胺、阿特拉津、脱乙基-阿特拉津、二甲双胍、普美灵和三氟拉林的检测结果。 对上述研究中农药的遗
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