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利用共代谢在光合细菌废水处理技术中加速合成淀粉废水的降解和养分的回收
卢海峰a，张光明b，卢玉峰c，吕元辉d，李宝明a和曹威a
a中国农业大学水资源与土木工程学院，北京100083； b中国人民大学环境与资源学院，北京100872； 哈尔滨工业大学城市水资源环境国家重点实验室，哈尔滨150090； 伊利诺伊大学厄本那-香槟分校农业与生物工程系，美国厄本那61801
摘要
淀粉废水是一种营养丰富的废水，其包含大量的大分子多糖物质。使用光合细菌（PSB）处理淀粉废水可以减少污染物并提高有用的生物产量。但是，PSB无法直接降解大分子多糖，这减弱了淀粉的降解作用效能。因此，在PSB废水处理中采用与基质共代谢的方式来促进淀粉降解。结果表明，利用PSB共代谢是一种高效的降解合成淀粉的方法。用苹果酸做最主要底物时，化学需氧量、总糖、大分子去除量和生物产量都比不使用基质时要高得多。苹果酸是淀粉降解过程中的主要底物，因此起着十分重要的作用。它可将alpha;-淀粉酶活性提升到46.8U，同时提高光合细菌的活性，这诱导大分子的降解过程。乙醇、乙酸和丙酸是废水处理的产物，乙醇是整个降解过程的主要产物。用苹果酸引入共代谢来处理废水可以加速大分子的降解和生物资源产量，并削弱酸化作用。此方法提供了从废水中回收生物资源的新途径。这种方法是可持续的环境友好的废水处理技术。
关键词: 光合细菌；共代谢；淀粉废水；基质；alpha;-淀粉酶活性
简介
淀粉废水是一种典型的营养丰富的废水。淀粉废水产生于玉米，土豆，小麦，大麦，燕麦等淀粉丰富的植物根部加工过程。淀粉废水中含有多种无毒的有机污染物，例如多糖，蛋白质和脂肪。淀粉废水的传统处理方法是活性污泥法处理。但是，在活性污泥降解有机污染物的过程中，污染物中大约50％的碳转化为CO2后释放到大气中，而其他50％的碳则被微生物吸收并最终形成活性污泥。剩余活性污泥很难处理，很容易造成二次污染。这种传统方法的缺点之一就是它没有涉及到资源回收。
当今资源紧缺已成危机，尤其是在水和营养短缺，这导致科学家和工程师们考虑回收这些资源。水资源循环利用方面，膜净化、臭氧消毒和紫外线消毒等技术逐渐完善。为回收氮（N）和磷（P）资源，通常采用絮凝法，如磷酸铵镁沉淀法。但是，这些类型的化学方法仅涉及从废水中回收水、氮和磷。碳（C）的回收不包括在内，并且这些方法很容易导致化学污染。因此，一些生物技术(如微藻-细菌/藻类，厌氧发酵和光发酵)不断产生。这些技术减少了污染物，还能从废水中产生高价值的产物，例如纯微藻类生物质、乙醇生物燃料、生物氢、纤维素、脂肪酶、挥发性脂肪酸（VFA）和多酚。光合细菌（PSB）废水处理技术是这些生物废水处理之一，这可能是回收碳氮磷、有用的生物量和高价值营养素并且不会造成二次污染的有效方法。
PSB废水处理技术具有许多优势。首先，PSB对高浓度废水耐受，菌群可以利用有机物质，在亮或暗的条件下进行氧化磷酸化。PSB降解污染物十分高效，先前的工作表明，PSB可以去除大豆废水中的90％的碳和大约60-80％的氮。其次，PSB可以产生有用的生物量，并且在废水处理过程中不会产生二次污染。PSB生物量比活性污泥更清洁（更卫生）并且无毒。其生物量包含单细胞蛋白、生物聚合物和胡萝卜素，可以回用做食品、医疗、服装和农产业的原料。淀粉废水的主要成分淀粉可以向PSB提供养分，特别是碳。碳可以被PSB吸收并直接用作农产业的原料。因此，使用PSB处理淀粉废水可去除污染物、回收营养物质、产生有用的生物量并避免二次污染。
然而，淀粉是一种典型的大分子物质，PSB很难降解。因此，必须将某些方法引入PSB废水处理中以提高淀粉分子的降解效率。共代谢是一种生物降解方法，用于处理有害和难降解的废水，其定义是两种化合物同时降解，其中第二种化合物（难处理物质）的降解取决于第一种化合物（也称为基质或可用材料）的存在。第一种化合物则是易被细菌降解的小分子。共代谢作为一种生化技术已被用于降解难降解废水以及乙烷、丙烷、丁烷和各种芳香族化合物（如苯，氯苯，氯酚、酚、氯甲苯、咪唑、吡啶和柠檬酸生产废水中的乙醇）。表现出共代谢现象的细菌、放线菌、真菌和微藻约有23–30种，包括无色杆菌属、嗜绿固氮菌、芽孢杆菌属、黄杆菌属、氢原单胞菌属、微细菌属、假单胞菌属、弧菌属、黄单胞菌属、诺卡氏菌属、黑曲霉、金黄色链霉菌、绿色木霉和小球藻。
在PSB处理淀粉废水过程中，主要成分（例如淀粉）可抵抗PSB降解。假设添加PSB可用的基质会明显促进淀粉降解。因此，这项工作的主要重点是（1）测试可行性和使用共代谢的PSB降解淀粉的效果；（2）优化基质的种类和剂量以加速淀粉降解；（3）研究在PSB降解淀粉废水中共代谢降解淀粉的可能机理；（4）评估在PSB废水处理技术中用共代谢方法降解大分子的潜力。
2 材料和方法
2.1 用料
使用先前研究中从土壤中分离出一株PSB（Rhodopseudomonas sphaeroides），使用摇瓶培养法进行培养。具体来说，就是将该菌株在恒温振荡器中以120rpm的转速在26–30°C的温度下培养48H。
这项工作中，使用了合成淀粉废水，它主要包括alpha;-直链淀粉（99.9％的纯度；美国西格玛化学公司）。首先，制备硫酸镁（MgSO4，120mg/L）、硫酸铵（(NH4)2SO4，100mg/L）、氯化钙（CaCl2，75mg/L）、磷酸二氢钾（KH2PO4，500mg/L）、磷酸氢二钾（K2HPO4，300mg/L）和乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-2Na，20mg/L）作为向PSB提供营养的溶液。然后，使用2.0mol/L的氢氧化钠（NaOH）将pH值调节至7.2，再将该溶液在121℃下灭菌30分钟后加入alpha;-直链淀粉。合成淀粉废水的初始化学需氧量（COD）、总糖、总氮（TN）和总磷（TP）分别为1524.6、6504.6、30.0和190.0mg/L。
使用七种小分子（基质）运行实验并建立空白对照组。七种小分子分别是琥珀酸钠、果糖、葡萄糖、苹果酸、酒石酸钾钠、乙醇和琥珀酸（天津科密欧化学试剂有限公司，中国），每种化学物质的纯度为98％。添加小分子后，每次运行的最终COD约为2000mg/L。选择的七种基质是PSB可以利用的普通碳物质。
2.2 实验步骤
使用1000mL烧瓶做生物反应器，每个烧瓶装满800mL合成淀粉废水。使用前，将烧瓶于121℃下灭菌30分钟。初始细菌浓度为280mg/L（20％，细胞数约为108CFU/mL），接种的细菌处于指数生长期。使用磁力搅拌器均匀混合细菌和废水。所有实验均在光厌氧条件下进行，条件如下：60瓦白炽灯提供大约170micro;mol光子/（m-2s-1）光强，氮气饱和（纯度为98％）后，用密封膜密封生物反应器以维持绝对厌氧条件，温度控制在26–32oC左右，培养时间持续120h。
2.3 分析方法
从每个生物反应器收集上清液：先在7000–9000times;g下离心10分钟，然后测定COD、总糖、苹果酸、VFA、乙醇、分子量分布和pH值，收集离心后的残留细菌用于alpha;-淀粉酶活性和生物量测试。测试COD、TN和TP时使用APHA标准方法；测试总糖时使用食品法典委员会的标准方法；监控pH值时使用pH计（PSH-3，上海精密科学仪器公司，中国）。
苹果酸则使用高效液相色谱法（HPLC，EssentiaLC-15C，日本岛津制作所（Shimadzu Corporation Company），日本）进行测试。首先将所有样品通过0.22mu;m膜过滤。HPLC条件设定如下：UV检测器波长为210nm；PrevailC18柱（尺寸为250times;4.6mm，直径为4mu;m，美国Sigma Chemicl Company），柱温为25oC；；流动相：乙腈（C2H3N，色谱纯，目录号：34,888，EINECS：608-001-00-3，Sigma Chemical Company，USA）和0.025mol/LKH2PO4（pH2.5)；C2H3N与KH2PO4的体积比为5:95，速度为1.0ml/min，进样量为5mu;l。
根据APHA标准方法，使用气相色谱仪（型号SP6890A，山东鲁南仪器厂，中国）用氢火焰离子化检测器和装有支撑物（GDX103，60/80目，山东鲁南仪器厂，中国）的不锈钢柱（2mtimes;5mm）分析VFA和乙醇。在100–200°C的温度范围内编程不锈钢柱的操作。使用氮气作为载气，流速为50mL/min。氢气作为燃烧气体（50毫升/分钟），氧气作为助燃气体（500毫升/分钟）。
使用最小化TFF系统（超滤设备系统，OAPMP220，美国颇尔公司），用超滤法评估分子量分布。将上清液用0.45micro;m膜过滤，然后通过100003000和650道尔顿（Da）膜过滤。总有机碳分析仪（TOC-VCPN，日本岛津制作所，日本）测试分子量分布的总有机碳（TOC）值。
使用改良的贝恩费尔德方法测量alpha;-淀粉酶活性。首先对样品进行如下预处理：离心后，将收集到的细菌重新悬浮在柠檬酸盐缓冲液（0.1mol/L柠檬酸液和0.1mol/L柠檬酸钠液的混合物中，体积比为9：29，离心管中pH为5.6）。将悬浮液在4oC下于7000–9000times;g离心5次。然后，将离心管冷冻在-21°C下12小时。将冷冻的细菌悬浮液在冰中用超声破碎20分钟（超声仪的功率为20瓦；Ju1101，上海巨峰集团有限公司，中国），该超声设备为浴池模型（250mL）。在细菌裂解过程中，将冰水混合物添加到超声设备中将浴池温度保持在0oC。然后，通过在4oC下以12,000rpm离心20分钟来收集作为粗的酶液上清液。
2.4统计分析
使用单向方差分析和多重比较方法（SPSS17.0）对数据进行统计分析。多个试剂瓶（n=3）作为重复样本，并检查数据的均方差和正态分布方差，显着性水平Plt;05。
3 结果与讨论
3.1 PSB与基质一同降解淀粉的可行性
在本次工作中，首先研究添加小分子（基质）对PSB降解淀粉的可行性。淀粉和小分子都对化学需氧量有贡献。淀粉和小分子都增加对化学需氧量。淀粉约占化学需氧量为75％，而小分子的化学需氧量约为25％（2.1节）。乙醇实验组外，在不同的小分子运行中，在96h时的COD去除率均高于40.0％（图1）。若没有小分子，空白实验的COD去除率仅为3.3％，因此在小分子存在下PSB可以降解淀粉。没有小分子，淀粉就不能被PSB降解。对于乙醇实验组，COD去除率仅为13.3％，这可能是由于乙醇对PSB的毒性作用所致。空白、丁二酸、琥珀酸钠、果糖、葡萄糖、苹果酸、钠钾和乙醇运行96h时，生物量分别达到316.2、1524.0、1726.3、1146.2、978.3、1936.5、1845.2和381.6mg/L。数据还显示PSB生物量有所增加。在苹果酸试验中观察到最高的COD去除量和生物产量。第96小时，该运行组的COD去除率和生物量分别达到95.0％和1936.5mg/L。
以上数据可以看出，没有小分子时淀粉不能被PSB降解。因此，当苹果酸是基质时，淀粉是PSB的难降解物质。但在试验开始时，苹果酸和淀粉都对COD有所贡献。在淀粉废水降解过程中，淀粉降解为糊精、蔗糖、麦芽糖和葡萄糖，所以淀粉降解过程中的化学需氧量由苹果酸、淀粉及其产物的化学需氧量组成。为了进一步检验PSB降解淀粉废水时的共代谢作用，以确定淀粉的降解（以COD表示），计算苹果酸浓度及其对COD的贡献。在另一个实验中，苹果酸浓度为270.0mg/L;因此，苹果酸产生的初始COD为193.3mg/L。苹果酸淀粉废水中COD的总初始浓度为2263.6mg/L；因此在试验开始时淀粉增加了2070.3mg/L的COD。合成淀粉废水的总COD和苹果酸浓度随时间降低（图2（a））。最终，合成废水的总COD在144h
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