以药物测试目的将流通式传感器阵列应用于细胞培中的细胞毒性评价
原文作者 Emilia Witkowska Nery, Elżbieta Jastrzębska, Kamil Żukowski, Wojciech Wroacute;blewski, Michał Chudy, Patrycja Ciosek
摘要：以药物筛选培养为目的细胞用各种各样的比色法/原子荧光光谱法，在微观体系下观察其生存能力。在这项工作中，我们提出用流通式传感器阵列评估细胞生存力，可以在串联的细胞生物反应器中的微观体系作为兼容检测系统连接的另一种方式。它表明，该设备能够呈现1,4-二恶烷和5-氟尿嘧啶细胞毒性作用检测和估计的细胞活力，这证明了它可用于微量真正的非侵入性，快速的，可靠的，连续治疗后的细胞培养监测。
关键词: 细胞毒性；细胞培养；阵列传感器；微观体系；流动分析
1. 介绍
目前细胞培养在许多研究领域发挥重要作用，例如在生物技术和制药行业。细胞培养和细胞存活分析的研究不断增加，这与新药物的发现和生产，以及再生医学的发展有关。细胞培养也可用于研究生物过程。
新药开发和实施是一个漫长而昂贵的过程。任何药物必须经过几个阶段的测试，才能证明该产品是有效的和安全的。此过程包括：识别一个特定的药物靶标，这是为了响应所述疾病、产品特性、药效学和药代动力学评价，临床前毒理学试验、调查新药(IND)申请、生物分析试验和临床试验。细胞培养在临床前的测试细胞水平中发挥重要作用。这些测试提供了剂量和安全标准的重要信息，并允许进行下一步的临床试验。使用细胞培养试验新药的有效性更容易因为细胞提供一个快速反应和代表的物质。同样重要的是，它限制了试验量对活的动物，按照3R原则(减小产生、再利用、再循环)。假设搜索的替代方法在实验测试中，以取代动物(Andersson and Van den Berg,2004; Bhadriraju and Chen,2002)。因此动物或人类来源的细胞培养物经常用于研究的新化合物，这是另一种选择，在临床前研究的体外药物测试的更经济和道德方法。新药测试在许多类型的细胞,主要是肿瘤细胞(Torisawa et al., 2005; Shackleton, 2010)。
用于药物测试的使用微芯片(称为芯片实验室)是一个很好的解决方案，虽然接壤研究的机会成本高，耗时长，但是也减少动物用于实验的量。微系统允许对特定药物化合物中良好的细胞微环境，维护测试细胞的表型特性所需的细胞反应的调查。微技术保证生物材料的整合，组织工程和细胞培养药物研究开发新型细胞培养平台(Dittrich and Manz, 2006; Wegil et al.2003; Wu et al., 2010; Zguris et al.,2005)。
有专用于在文献中描述的细胞分析微流体系统的许多例子。微系统的组件应该主要是生物相容的，无毒的细胞，它们也应允许微观结构的制造。可使用各种材料，包括硅、玻璃、陶瓷以及各种类型的聚合物(如聚甲基硅氧烷PDMS)(Gomez,2008; Kang et al.,2008; Komen et al.,2008; Li et al.,2004; Velve-Casquillas et al., 2010;Vozzi et al., 2003; Zhang et al., 2009)。
透明材料允许细胞和亚细胞结构的光学调查，而且它们能够利用的大多数基于外源荧光团或转染的荧光报告标准细胞存活力测试和细胞毒性测定。但是，荧光团和漂白的潜在的细胞毒性是基于荧光的方法必不可少的问题。此外,这些化验不能连续使用在相同的样本,因此实时监测成为问题(Starly and Choubey, 2008)。另外，使用在微流体系统的荧光团是复杂的，由于细胞培养物的快速和均匀渗透必要性。因此用无创检测方法判断出细胞毒性刺激的生化反应是十分需要的，可以用微量细胞生物反应器的完全集成。细胞生长和增殖过程中改变五个主要因素可用于控制细胞代谢：葡萄糖，乳酸和氧浓度，pH值，热。为了这个目的几个装置已经提出，其中大部分是基于ISFETs，克拉克电极，阻抗谱等。(Adami et al., 2013; Burdallo and Jimeacute;nez-Jorquera, 2009; Eklund et al., 2006; Krommenhoek et al., 2007, 2008; Lorenzelli et al., 2003; Martinoia et al., 2001; Thedinga et al., 2007)。
在这项工作中，我们提出用小型电位流动液传感器阵列的毒性作用来实时监测细胞中的培养物，它是与细胞微生物反应器兼容。所开发的系统是分析1,4-二恶烷和5-氟尿嘧啶毒性，再结合偏最小二乘法 (PLS)对A549 细胞标准细胞毒性测试。
2. 实验
2.1.传感器阵列
一个集成的固态金微电极是捏造双面镀铜玻璃棉与环氧树脂浸泡,利用印刷电路板(PCB)技术(Ciosek et al.,2009a)。最后16个微电极与导电路径的模式是通过电化学，将镍层和金层的沉积在铜表面。最后阶段是将上述涂层与环氧玻璃的另一层(无铜覆盖)结构的热压粘合制成绝缘电路径。利用绝缘层中钻孔的孔，创建的舱室充满膜，这是个解决方案。集成阵列的制造的细节可以在别处找到(Toczyłowska-Maminska et al.,2008).
传感器阵列由7种膜电极:4个离子选择性(K ，Na ，H ,Ca2 选择性)和3部分选择性(对胺选择性、“阳离子选择性”和“阴离子选择性”)。该传感器有两个电极的类型。双电极无膜可作为氧化还原传感器。该膜包含合适的离子载体，20-50mol%（相对于离子载体）的亲脂性盐，61-66wt%增塑剂，和31-33wt%高分子量聚氯乙烯(见表S1中补充数据)。
之前详细讨论了制备与沉淀 (Ciosek et al., 2004a, 2004b)。三种类型的聚合物基质的进行了测试(聚氨酯，聚氨酯:聚氯乙烯1:1，和聚丙烯酸酯）。以小型双结电极施加银/氯化银作为参考电极。所有细胞的测量进行了以下类型: Ag,AgCl;KCl 3M│CH3COOLi 1M│sample solution║membrane║Au.。电位复用器(EMF16接口，劳森实验室公司，Malvern, USA)被用于电动势的测量。
2.2.传感器阵列测量微流系统
微流系统制造与使用的一些聚合物层，从而形成固定器为一体的PCB传感器阵列。采用AutoCAD和三维可视化设计系统。
微通道进行微系统来解决电极的空腔。在微尺度流体流动规律不同于那些用于宏观设备和微流体的基本特征之一是层流，所以体积/表面比粘度必须考虑到。忽略影响基于相互影响的分子不再是可能的，因此辅助微流体系统的设计与预先建模和模拟程序装置是很重要的。
在我们的工作中，所有的模型和仿真与COMSOL多重物理量进行（COMSOL组）采用不可压缩斯托克斯方程。假定通道内流体流动为水，入口压力为20Pa，出口压力为0，温度为25℃。还假定液体在墙的附近没有移动，整个装置是由有机玻璃制成的。考虑到液体与壁面之间的相互作用，采用平面应变模型。模型网格被定义为超细。
流动建模之后，选择合适的信道体系结构。所述微通道用微铣削的方法通过微铣床数控(Minitech Mini-Mill 3 Pro)的其允许高精度和可重复性的方法制成。控制阶段的步进电机采用微型步进，和一个分辨率XYZ达到约1mu;m。该系统的可重复性，包括主轴运行已被实验发现小于5mu;m时，工作在几厘米的范围，这是通常用于微流体装置的尺寸。第一阶段包括在执行一个微通道在AutoCAD，其与CAM软件的帮助下被转化为G代码控制微铣削机器的操作的一个项目。所执行的微通道具有矩形横截面，它是800mu;m宽和500mu;m深。
2.3. 细胞培养和细胞毒性试验
A549细胞(人肺腺癌上皮细胞;美国典型培养物保藏中心)在补充有10％胎牛血清MEME培养基(Sigma Aldrich公司)中培养(FBS; Sigma)，2 mmol/L-谷氨酰胺(Sigma)，100U/mL青霉素(Sigma)和100mu;g/mL链霉素(Sigma)生长直到融合，随后将细胞通过胰蛋白酶消化进行传代培养。将细胞接种在1times;104/孔密度的黑壁96孔板。24小时后，附着在底部生长的细胞用不同浓度的制作的试验化合物处理(1,4-二恶烷和5-氟尿嘧啶作为染毒剂)在完全培养基24小时。试剂培养后，除去培养基，加入50ml钙荧光素-AM(CAM，2mu;M)，并将细胞在37℃下培养30分钟。在PBS细胞的染色和洗涤后，加入新鲜的培养基和绿色荧光后，使用荧光板计数器瓦里安(荧光分光光度计)在485nm(激发)和538nm(发射)波长处测定。
化合物的浓度梯度范围是从1,4-二恶烷0 -20 %v/v以及0-300 mu;M 的5-氟尿嘧啶。 将1,4-二恶烷稀释，用于培养基培养。5-氟尿嘧啶溶解于100%二甲基亚砜(DMSO; Sigma)中，然后用培养基稀释。DMSO的最终浓度保持在0.2%，这对细胞生长和存活没有影响。
2.4. 数据分析
利用稳态响应16个传感器(2个电极的每一种类型)的印刷电路板阵列传感器阵列的化学图像的研究样品的细胞培养基中，每个样品的特点是16个变量。经测量，两个数据矩阵进行了研究：第一，从实验中使用含有1,4-二恶烷的化学图像，第二，从实验中有5-氟尿嘧啶样品的化学图像。矩阵作为输入部分，然后以最小二乘法（PLS）和偏最小二乘判别分析（PLSDA）模型。用Matlab（MathWorks公司，纳提克，美国）和Origin（Microcal公司软件公司，北安普顿，美国）软件进行所有的计算和数据分析。
3.结果与讨论
细胞不断地接收和发送信息，无论是物理和化学，信号可以来自细胞本身或周围环境。这种类型的信息可以激活特定的代谢途径，测定蛋白质的分泌，决定是否开始有丝分裂或程序性死亡，或简单地促进生长。细胞培养监测通常集中在检测特定的代谢物，一般状态的整体培养，死亡细胞的数目或死亡类型（细胞凋亡，坏死）。传感器用于细胞培养应用程序应该能够测量样品事先准备和可能没有其他试剂的使用。装置应该至少使用一个常用的-在细胞培养实验室易于消毒的方法，而且材料不能是有毒的且容易蛋白质的吸收。在使用串联但是流过测量，最后的假设是不必要的。
在文献中提出的监测系统迄今主要是基于电化学和光学技术。阻抗谱(IS) (Schwarzenberger et al., 2010)允许看到有毒试剂的影响和细胞培养能力恢复。细胞作为绝缘体因此阻抗的变化提供了信息增长,增殖、粘附和运动。石英晶体传感器采用CCD微型照相机(Kang et al.2010; Lee et al., 2009)进行了测试细胞毒性筛选。这种类型的设备的CCD照相机提供有关微量天平细胞形态和他们的粘附和生长数据。不幸的是上述方法在细胞生长的电极不适合非粘附细胞类型。许多类型的贴壁细胞的结构有其要求，它们生长的结构，有些需要一个额外的层的其他细胞，如成纤维细胞。提出了其他设备使用共焦荧光检测(Choi et al., 2010)。系统允许在传统的培养皿和微型显微镜安装在一个标准的哺乳动物细胞培养的生长。该装置进行了测试的细胞毒性，细胞浸润实验。即使该系统适用于连续测量，细胞标记仍然影响着培养，防止长时间的监测。我们还缺乏基于荧光适合测定代谢水平或细胞的电活动的方法。Clark et al. (2010)介绍了一种新型多层微流控芯片，它包括细胞生长和检测的一个设备。能够监测脂肪酸的荧光为基础的酶检测的系统。
另一方面，细胞培养基的测量执行都在串联的细胞微生物反应器流通探测器，用于监测的真正非侵入性的方法提供了机会。在我们以前的工作中，我们呈现，该电位微型传感器阵列能够监控细胞培养(Ciosek et al., 2009b)。传感器阵列耦合与主成分分析(PCA)允许检测媒体变化与各种媒体提供各种细胞生长和二恶烷的毒性作用。该应用的设备用于固定式测量，因此在这项工作中，我们开发了一个自定义的外壳，用来钻微通道和紧固的参比电极。
保持器装置应允许在膜附近的电极最佳流体流动，微通道和传感器阵列之间的良好的和容易的调整，可重复密封的系统和安装的小型化的参考电极。常用的材料，例如持有者的PDMS，聚甲基丙烯酸甲酯（由复制方法形成的：冲压，注塑，和通过直接加工：微细铣削，激光）和玻璃（通过光刻法和湿法蚀刻形成）。在这项工作中，环氧玻璃层压多传感器装置(Ciosek et al.2009a; Ciosek and Wroacute;blewski, 2008)以前在我们的实验室作为一个传感器阵列。传感器阵列的壳体的所有部分由PMMA制作，PDMS只有制成密封件。该技术提出的传感器阵列的制造技术是相当简单和快速。用于这一目的(PMMA,PDMS)的材料是廉价的，透明的，并且容易进行加工。整个测量系统的装配是快速和容易。流经细胞培养基的分离装置提供了分析作为一个独立的模块, 因为这样的结构有以下几个重要的优点：
-它是真正的无创
-该研究的细胞培养可以测试多次研究毒性作用，不仅是一次例如像在荧光标记的情况下。
-独立样本流路线可以避免污染的细胞培养基从电极通过电活性膜组件培养细胞的膜,这可能是有毒的,因此可能会影响显著的药物测试的结果。
-没有必要用于放置电子连接器，插件，导线在细胞培养孵化器，因为它们也可以导致其污染。
-不需要灭菌。
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