OTX2是参与的区域规范防止开发视网膜色素上皮Sox2的和FGF8的表达，这些因素诱导视网膜神经分化外文翻译资料

 2023-01-10 02:01

Otx2IsInvolvedintheRegionalSpecificationofthe

DevelopingRetinalPigmentEpitheliumbyPreventing

theExpressionofSox2andFgf8,FactorsThatInduce

NeuralRetinaDifferentiation

DaisukeNishihara1,3,IchiroYajima2,HiromasaTabata3,MasatoNakai3,NagaharuTsukiji1,

TatsuyaKatahira4,KazuhisaTakeda5,ShigekiShibahara5,HarukazuNakamura1,6,HiroakiYamamoto3*

1DepartmentofDevelopmentalBiologyandNeurosciences,GraduateSchoolofLifeSciences,TohokuUniversity,Sendai,Miyagi,Japan,2UnitofEnvironmentalHealth

Sciences,DepartmentofBiomedicalSciences,CollegeofLifeandHealthSciences,ChubuUniversity,Kasugai,Aichi,Japan,3FacultyofBioscience,NagahamaInstituteof

Bio-ScienceandTechnology,Nagahama,Shiga,Japan,4LaboratoryofDevelopmentalNeurobiology,GraduateSchoolofBrainScience,DoshishaUniversity,Kyotanabe,

Kyoto,Japan,5DepartmentofMolecularBiologyandAppliedPhysiology,TohokuUniversitySchoolofMedicine,Sendai,Miyagi,Japan,6DepartmentofMolecular

Neurobiology,GraduateSchoolofLifeSciencesandInstituteofDevelopment,AgingandCancer,TohokuUniversity,Sendai,Miyagi,Japan

Abstract

Theretinalpigmentepithelium(RPE)sharesitsdevelopmentaloriginwiththeneuralretina(NR).WhenRPEdevelopmentis

disrupted,cellsinthepresumptiveRPEregionabnormallydifferentiateintoNR-likecells.Therefore,thepreventionofNR

differentiationinthepresumptiveRPEareaseemstobeessentialforregionalizingtheRPEduringeyedevelopment.

However,itsmolecularmechanismsarenotfullyunderstood.Inthisstudy,weconductedafunctionalinhibitionofa

transcriptionfactorOtx2,whichisrequiredforRPEdevelopment,usingearlychickembryos.Thefunctionalinhibitionof

Otx2inchickeyes,usingarecombinantgeneencodingadominantnegativeformofOtx2,causedtheouterlayerofthe

opticcup(theregionformingtheRPE,whenembryosnormallydevelop)toabnormallyformanectopicNR.Inthatectopic

NR,thecharacteristicsoftheRPEdidnotappearandNRmarkerswereectopicallyexpressed.Intriguingly,therepressionof

Otx2functionalsocausedtheectopicexpressionofFgf8andSox2intheouterlayeroftheopticcup(thepresumptiveRPE

regionofnormallydevelopingeyes).ThesetwofactorsareknowntobecapableofinducingNRcelldifferentiationinthe

presumptiveRPEregion,andarenotexpressedinthenormallydevelopingRPEregion.Here,wesuggestthatOtx2prevents

thepresumptiveRPEregionfromformingtheNRbyrepressingtheexpressionofbothFgf8andSox2whichinducetheNR

cellfate.

Citation:NishiharaD,YajimaI,TabataH,NakaiM,TsukijiN,etal.(2012)Otx2IsInvolvedintheRegionalSpecificationoftheDevelopingRetinalPigment

EpitheliumbyPreventingtheExpressionofSox2andFgf8,FactorsThatInduceNeuralRetinaDifferentiation.PLoSONE7(11):e48879.doi:10.1371/

journal.pone.0048879

Editor:JustinKumar,IndianaUniversity,UnitedStatesofAmerica

ReceivedAugust15,2012;AcceptedOctober2,2012;PublishedNovember8,2012

Copyright:szlig;2012Nishiharaetal.Thisisanopen-accessarticledistributedunderthetermsoftheCreativeCommonsAttributionLicense,whichpermits

unrestricteduse,distribution,andreproductioninanymedium,providedtheoriginalauthorandsourcearecredited.

Funding:ThisworkwaspartlysupportedbytheJapanSocietyforthePromotionofScience(JSPS)toDN(10J07029,http://www.jsps.go.jp/)andtoIY,anda

Grant-inAidfromtheMinistryofEducation,Culture,Sports,ScienceandTechnology,Japan,toHY.Thefundershadnoroleinstudydesign,datacollectionand

analysis,decisiontopublish,orpreparationofthemanuscript.

CompetingInterests:Theauthorshavedeclaredthatnocompetinginterestsexist.

*E-mail:h_yamamoto@nagahama-i-bio.ac.jp

Introduction

Theretinalpigmentepithelium(RPE),onecomponentofthe

vertebrateeye,consistsofamonolayerofmelanin-producingcells.

BoththeRPEandtheneuralretina(NR),whichcontains

photoreceptors,retinalganglioncells(RGC),horizontalcells,

amacrinecells,bipolarcellsandMuuml;llergliacells,originatefrom

thesameeyeprimordium,calledtheopticvesicle(OV),which

derivesfromthelateralwalloftheforebrain.Theinductive

interactionsbetweentheOVandthesurfaceectoderm(thefuture

lens)resultintheinvaginationoftheOVtoformthebilayered

opticcup(OC),inwhichtheouterandinnerlayersarespecified

intotheRPEandNR,respectively[1,2].

ThedevelopmentoftheRPEispromotedbyseveral

transcriptionfactors,whicharespecificallyexpressedinthe

presumptiveRPEregion;Microphthalmia-associatedtranscriptionfactor

(Mitf)andOrthodenticlehomeobox1and2(Otx1and2).Mitfpromotes

melaninsynthesisandregulatescellproliferationinthedeveloping

RPE[3].Inmutantmicewithnon-functionalallelesoftheMitf

gene,anon-pigmentedNR-liketissueisectopicallyformedinthe

outerlayeroftheOC[4,5].TheexpressionofMitfinthe

presumptiveRPEregionrequiresthefunctionofOtxgenes[6].

CompoundmutationsinOtx1and2(allOtx12/2;Otx2 /2mice

and30%ofOtx1 /2;Otx2 /2mice)resultinthedown-regulation

ofMitfexpressionandtheectopicformationofNR-liketissuein

theouterlayeroftheOC,althoughOtx12/2micedonotdisplay

significantdefectsintheRPE[6].Still,inspiteofthesekey

findingsinmutantmice,itisunclearwhethertheloss-of-function

ofOtx2affectsRPEdevelopment,sincetheheadregionincluding

theeyesisnotformedinOtx22/2mice[7,8].However,previous

reportshavepointedouttherolesofOtx2asanupstream

regulatorofMitfexpressionandthepromotionofRPE

differentiation[9,10].Inculturedquailretinacells,transfection

ofOtx2inducesapigmentedphenotypewithMitfexpression[9].

PLOSONE|www.plosone.org1November2012|Volume7|Issue11|e48879

InthechickNR,co-transfectionofOtx2andaconstitutivelyactive

formofb-catenininducestheectopicexpressionofMitf[10].

WhileRPEdevelopmentrequiresthefunctionsofMitfandOtx,

NRdifferentiationisinducedbyseveralothertranscriptionand

growthfactors,includingFibroblastgrowthfactor8(Fgf8),

SubgroupB1SRY-boxfamilygenes(SoxB1)andPaired-box6

(Pax6).WhenFGF8-soakedbeadsareplacedinthevicinityof

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OTX2是参与的区域规范防止开发视网膜色素上皮Sox2的和FGF8的表达，这些因素诱导视网膜神经分化

发育生物学系1和神经，生命科学，东北大学，仙台，宫城县，日本，环境卫生的2单元研究生院

科学，生物医学科学，生命和健康科学，中部大学，春日井，日本爱知县，生物科学3学部长浜学院学院系

生物科技，长滨，滋贺县，日本，4发育神经生物学，脑科学的研究生院，同志社大学，京田边的实验室，日本京都

摘要：

视网膜色素上皮细胞（RPE）共享其与神经视网膜（NR）的发育起源。当RPE发展破碎，将细胞在推定RPE区域异常分化为NR样细胞。因此，预防的NR分化推定RPE区域似乎是眼睛发育过程中的区域化RPE至关重要。然而，它的分子机制尚不完全清楚。在这项研究中，我们进行了转录的实际功能抑制。

介绍：

视网膜色素上皮细胞（RPE）中，脊椎动物眼的一个组成部分，包括黑色素产生细胞的一个单层。两个RPE细胞和神经视网膜（NR），其中包含光感受器，视网膜神经节细胞（RGC），水平细胞，无长突细胞，双极细胞和米勒胶质细胞，从同一只眼睛原基起源，称为视泡（OV），从该前脑的侧壁导出。在OV和表面外胚层（将来透镜）之间的感应相互作用导致OV的内陷形成双层视杯（OC），其中，所述外层和内层被指定到RPE和NR分别[1 ，2]。

RPE中的发展是由几个转录因子，其在所述推定的RPE区域特异性表达促进;小眼相关转录因子（MITF）和Orthodenticle同源框1和2（OTX1和2）。 MITF促进黑色素合成和调节细胞增殖中的显影RPE [3]。与MITF基因的非功能性等位基因的突变小鼠中，异位形成在所述OC [4,5]的外层一个未着色NR样组织。 MITF在推定RPE区域的表达需要OTX基因[6]的功能。在OTX1和2化合物突变（所有Otx12 / 2; OTX2 / 2小鼠和OTX1 / 2的30％; OTX2 / 2小鼠）导致MITF表达的下调和在外部的异位形成NR样组织在OC层，虽然Otx12 / 2鼠标不显示在RPE显著缺陷[6]。不过，尽管在突变的小鼠，这些重要发现的，目前还不清楚损失的功能OTX2的是否影响RPE的发展，因为在Otx22 / 2鼠[7,8]没有形成包括眼睛的头部区域。不过，以前的报告中所指出的那样OTX2的角色MITF表达的上游调节和促进RPE分化[9,10]。在培养的鹌鹑视网膜细胞，OTX2转染诱导与MITF表达[9]的着色的表型。

在小鸡NR，OTX2的共转染和beta;-联蛋白的组成型活性形式诱导MITF [10]的异位表达。虽然RPE发展需要MITF和OTX的功能，NR分化是由其他几个转录和生长因子，包括成纤维细胞生长因子8（FGF8），小组B1 SRY-box家族基因（SoxB1）和配对盒6（Pax6的）引起的。当FGF8浸泡珠粒放置在显影RPE的附近，将细胞在RPE中改变它们的命运分化

成NR细胞[11]。其结果是，在OC外层的某些区域形成非着色异位NR这需要对一个分层结构，并显示了NR [11]的几个分化标记。同样，NR的异位形成也可以通过SoxB1或Pax6的的错误表达在所述OC外层引起

[12,13]。的FGF8和SoxB1基因在NR中表达，而不是在视网膜色素上皮[11,12]。 PAX6也成为从推定的RPE缺席，尽管其表达期间眼睛的发育[14,15]的早期阶段在RPE中检测到。虽然这些因素的表达模式是众所周知的，但值得注意的是，目前还不清楚这些因素如何限制在NR区域和发育正常的眼睛从RPE区域消失。揭开如何FGF8，SoxB1和Pax6的表达结构域在所述OC的外层被下调可能导致理解涉及在RPE中的区域化的机制（S）。

因为OTX2和MITF在所述OC（该区域形成的RPE，当胚胎正常发育）的外层中特异性表达，这是可能的，这些特定的RPE因素参与在FGF8，SoxB1和Pax6的的下调外层

的OC。这里，我们进行OTX2的功能抑制在显影眼，使用鸡胚。鸡胚用编码OTX2被证实抑制野生型OTX2的功能在体外的显性负形式的重组基因转染。在小鸡的眼睛OTX2的功能性抑制引起视杯（通常显影眼睛的视网膜色素上皮区域）的外层到异常形成异位NR。在异位NR，视网膜色素上皮的特性并未和NR标记进行异位表达。有趣的是，OTX2函数的repres-锡永也引起FGF8和Sox2的异位表达在所述OC的外层（该SoxB1家族成员之一），而的Pax6的表达降低。我们的数据表明，OTX2防止所述OC的外层从通过抑制FGF8和Sox2，其可以强制地诱导NR分化[11,12]的表达形成了NR。

结果

OTX2表达模式和ENR-OTX2的显性负活动

首先，我们比较OTX2与MITF在OV和OC阶段的表达模式。在HH10鸡胚，OTX2在OV（图1A星号）的很大一部分被表达，虽然其表现在OV的腹侧部很微弱。 MITF未在OV在HH10鸡胚（图1B）表示。从HH12-13，MITF表达可以在OV（图1D箭头）的背侧部进行检测。在相同的阶段，OTX2的高度在OV（图1C中箭头），类似MITF的表达模式的背侧部分表示。成立业主立案法团后，双方OTX2和MITF的表达在视网膜色素上皮形成（图1E和F）的业主立案法团的外层明显。

对于OTX2的功能抑制，我们使用的编码OTX2的显性负形式，称为EnR- OTX2的重组基因。 ENR-OTX2编码小鸡OTX2融合到果蝇ENGRAILED抑制结构域（ENR）。我们证实了ENR-OTX2的在体外试验中显性阴性活性。与先前的研究，结果表明OTX2激活对DCT基因启动子[16]，小鸡野生型OTX2（WTO TX2）一致开车在D407培养细胞对DCT子（泳道1和2中图1G）。 WTO TX2的这个功能被阻断ENR-OTX2（图1G泳道3），这表明ENR-OTX2可用于OTX2的功能抑制。如所预期的，对DCT启动子不是由ENR-OTX2（泳道5图1G）激活。 ENR-Otx2DC，其编码ENR-OTX2没有其C末端DNA结合结构域，也没有抑制wtOtx2（泳道4在图1G）的活性。

视网膜色素上皮特性的损失ENR-OTX2

转

为了解决OTX2如何促进RPE发展鸡胚，我们进行基因转染实验。 [3]的HH9-11鸡胚中的OV（孵育1.5天）与PMIⅢ-ENR-OTX2，并使用在卵内电GFP的表达载体（pCAGGS- EGFP）转染，如先前所述进行。对于控制，无论是pMiwI空载体pCAGGS中-EGFP转染。培养2天后，转染胚胎固定并观察准备。如在正常显影的眼睛的情况下，控制眼睛有一个黑色的色彩以外的透镜（15）中，由于分化的RPE细胞合成黑色素色素（对应HH20-22胚，图2A-C）。然而，ENR-OTX2转染眼揭示了在GFP阳性部的高度降低色素沉着（23，在图2D-F括号）。

为了解决ENR-OTX2如何影响分化和所述OC的外层（一般显影眼睛的推定RPE区域）的形态的状态，ENR-Otx2-的部分转染或控制眼进行染色视网膜色素上皮分化标志物。在对照眼，没有观察到明显的形态改变（图2G-L）和所述OC（推定RPE区域）的外层保持了单层结构（括号中的图2G）。与此相反，ENR-OTX2引起在所述OC的外层中形成（对比图2G和M之间括号）异常增厚组织。在此加厚外层（夹在虚线之间的区域），几乎检不颜料颗粒。此外，一些ENR-OTX2染眼睛没有保持其杯状结构，以形成一个OV状结构（图20-R），以及透镜的大小在ENR-OTX2转染眼似乎降低（比较封闭在图2M和O的与图2G）的虚线区域。

在ENR-OTX2转染眼（图2M-R），MITF的表达成为减弱了加厚外层（图2M和N）的一个大的部分，并且只在所述GFP阴性区域检测MITF信号加厚外层（图2M和N箭头）。视网膜色素上皮，多巴色素互变（DCT，编码黑色黑色素合成所需要的酶）和melanosomal基质蛋白115的分化标志物（MMP115）[3,17,18]，也无法在这些眼睛检测时（之间的区域如图2P和R虚线）。与此相反，MITF，DCT和MMP115中的对照眼（图2G- L）的所述OC（推定RPE区域）的外层中特异表达。因此，在所述OC（推定RPE区域）的外层适当形态发生和分化由EnR- OTX2错误表达打乱。

在OC外层NR标记的异位表达继ENR-OTX2

转

接下来，我们考察了几个NR标志物的表达模式。这是可能的ENR-OTX2染引起所述OC的外层到异常分化成NR代替RPE中，由于在外侧形成的异位NR状组织被

OTX1和OTX2复合突变小鼠的OC层[6]。此外，先前的研究已经表明，RPE分享共同发育原点（OV）与NR和也具有分化成了NR [11,12,13,19,20,21,22,23,24的潜力， 25,26]。

为了分析NR标志物的表达，将胚胎在胚胎阶段HH9-11转染，然后再培养2​​天以达到HH20-22 embryos.In显影NR，在有丝分裂后神经节细胞被检测Islet1转录因子，迁移无长突细胞[11,12,27]，而RNA结合蛋白HUC / D在分化的神经元细胞[21,28,29]表示。在控制眼里，NR这些分化标志物的表达玻璃体面（面对透镜的表面上，被描述为（ⅴ）在图3C和F）了NR（在图3B和E箭头），但不能在所述OC /推定RPE区域的外层被检测（区域在图3B中，C，E和F）的虚线之间。此外，磷酸组蛋白H3（PHH3）阳性的有丝分裂的细胞位于所述巩膜表面的NR的（透镜对面）在图3I的表面上，被描述为（多个）中的对照眼（图3H箭头），如在正常显影的眼睛的情况。在这些眼睛，只有RPE细胞的少数阳性PHH3（在图3H和我的虚线之间的区域）。在ENR-OTX2转染眼，不仅了NR而且增稠外层为阳性于克/ D和Islet1（图3J-Q）。巩膜表面上进行检测Islet1或HUC / D的异位信号（透镜相反的表面，在图3L和Q描述为（S））的加厚外层（如图3K和N箭头）的。此外，在玻璃体表面（表面朝向镜头，被描述为（ⅴ）在增稠外层图3R），进行检测（图3Q箭头）最PHH3阳性细胞。 PHH3对于克/ D和Islet1的相对侧中增稠外层的分布拓扑模仿这些因素在发育正常NR的分布。这些数据表明，在所述OC的外层一个异位NR形成该ENR-OTX2错误表达的结果。

在NR分化或参与的因素眼睛的发育等方面ENR-OTX2的影响

在所述OC外层异位NR形成（推定RPE区域）也可以由一些转录因子或分泌的因子，其在所述OC表达诱导。例如，转录错误表达因子SOX1，2或3（SoxB1）或Pax6的引起所述OC外层异位形成了NR的（推定RPE区域）[12,13]。的FGF8浸泡珠在显影RPE附近的应用还导致在异位NR形成[11]。在正常显影的眼睛，在NR [11,12,14,15]检测SOX1，2和3（SoxB1）的Pax6和FGF8的表达。值得注意的是，SoxB1和FGF8所述OC形成[11,12]后，不会在正常显影的RPE表达。虽然Pax6的在OC形成后发育正常RPE表达，其表达与推定RPE地区眼睛的发育进一步进行，[14,15]消失。换句话说，SoxB1，Pax6的和FGF8的表达结构域，

这诱导分化NR最终成为正常的眼睛发育过程中受限于推定NR区域。在这一点来看，我们测试这些因素表达是否在由ENR-OTX2染异位NR诱导。对于这种分析，将胚在胚胎阶段HH9-11转染，然后再培养2​​天以达到HH20-22胚胎。

在对照眼，Sox2的未在所述OC外层的大部分表达（RPE中区域，在图4B和C中的虚线之间的区域）中的NR（图4A-被检测到，但其表达 C）。在这些眼睛，Sox2的未在周边表达（图4A中的箭头）或中央视网膜色素上皮，虽然只有近端RPE（图4A中的星号）的一小部分是正面为Sox2的信号（在图4B中箭头）。与此相反，ENR-OTX2的转染引起Sox2的在所述OC/异位NR的加厚外层异位表达（图4K和L的虚线之间的区域）。在增厚外层/异位NR之后ENR-OTX2转（图4J-L）的周边，中部和近端地区检测Sox2的表达。此外，不同于在Islet1和HUC/ D的情况下，Sox2的不仅在基底的一面，但在跨顶 - 基底轴线（图4K和L）的整个范围的异位NR的表达。

类似SOX2，ENR-OTX2诱导的OC的加厚外层FGF8的异位表达/异位NR（图5B和D-F）。在正常的眼中，FGF8在NR的中央部分中表达但不在所述OC/推定RPE区域（图5A和C）的外层。有趣的是，在背和由ENR-OTX2转染诱导的异位囊泡了NR的腹侧部分还检测FGF8异位表达似乎有端脑的特征。

讨论

在小鸡的眼睛上OTX2功能的镇压

如Otx12 / 2的情况下; OTX2 / 2小鼠[6]，小鸡眼睛显示在所述OC的外层一个异位NR的形成中，作为OTX2的严重受损功能的结果。业主立案法团的外层开始形成以下ENR-OTX2转的未染色厚的结构。在这个组织中，一些RPE-特异性标记（MITF，DCT和MMP115）的表达减少，但，相反，检测到的NR（HUC / D和Islet1）的几个分化标记物的表达。此外，ENR-OTX2的表达也引起在显影眼细胞增殖和凋亡的增加，类似Otx12 / 2; OTX2 / 2小鼠[6]。

OTX2的功能都伴有区域

视网膜色素上皮的规格

两个RPE和NR由相同的发育源衍生。作为眼球发育的进行，推定RPE和NR区域成为分别细分为所述OC的外层和内层。这项研究的一个重点是在RPE和NR这些区域规范阐明了如何OTX2功能。

我们分析了促成NR发展因子的表达模式。其中，Sox2的和FGF8在以下ENR-OTX2染所述OC的外层被异位表达。相比之下，的Pax6的表情似乎在宫外NR被降低，并有在Six3或LHX2无明显变化。考虑到Sox2的和FG

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