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红酵母菌YB-252固态发酵产生类胡萝卜素的研究
AyerimHernaacute; ndez-Almanzaa, JulioMontantilde; ez-Saacute; enza, Cristian Martıacute;nez-Aacute; vilab, Rauacute; l Rodrıacute;guez-Herreraa, Cristoacute; bal N.Aguilara,n
aGroup of Bioprocesses,Department of Food Science and Technology,School of Chemistry,UniversidadAutonomade Coahuila,Saltillo,25280Coahuila,Meacute;xico bLaboratory of Biotechnology,School of Agronomy,UniversidadAutoacute;nomade NuevoLeoacute;n,General Escobedo,NL,Meacute;xico
摘要：类胡萝卜素是一类在医药、化学、食品和饲料工业中有重要作用的分子。在本研究中，使用Praytt-Burman设计来评价pH值、水分、碳源、接种浓度、时间、培养箱温度和诱导剂浓度的影响。同时，测试了代谢抑制剂对beta;-胡萝卜素的累积的影响，证明125ppm的抑制剂浓度下在产生番茄红素的同时没有beta;-胡萝卜素副产物产生。结果表明，最高的番茄红素产量为340mg / L。在评价的参数中，诱导剂浓度、发酵时间和系统中的水分百分比，对红酵母菌YB-252固态发酵生产类胡萝卜素有着显著影响。
关键词：红酵母，类胡萝卜素，固态发酵，代谢抑制剂
1 介绍
类胡萝卜素是一类在医药、化学、食品和饲料工业中有重要作用的分子，不仅是因为它们是维生素A前体，而且它们的着色，抗氧化和可抑制肿瘤活动（Buzzini，2000; Frengova＆Beshkova，2009; Martini等，2010; Libkind＆Broock，2006）。传统上，植物提取物可作为类胡萝卜素的来源。但是，有着原料供应不足或不稳定的的问题（Maldonade, Rodriguez-Amaya, amp; Scamparini, 2008）。生产类胡萝卜素的微生物没有这些缺点，它们可以子生产过程中利用天然的基体或合成的低成本基体。有报道指出，在工业生产类胡萝卜素中，红酵母属菌被频繁使用在不同的农业产业原料中。红酵母菌已经被用于beta;-胡萝卜素的微生物生产，然而，已经发现用2-(4-氯苯硫基)-三乙胺、咪唑、吡啶和哌啶处理这类微生物会导致番茄红素的积累(Loacute;pez-Nieto et al., 2004; Choudhari, Laxmi, amp; Singhal, 2008)。
番茄红素是由异戊二烯衍生而来的，其主要特征是多烯存在的长碳链（双键可以存在三到十五个），负责被人眼感知到的颜色。(Yurkov, Vustin, Tyaglov, Maksimova, amp; Sineokiy, 2008; Rodrigues, Mariutti, Chisteacute;, amp; Mercadante, 2012)。番茄红素是各种常见的类胡萝卜素中最有效的抗氧化剂，它可以被用于预防心血管疾病并治疗几类癌症。番茄红素能抑制胆固醇的合成，促进低密度脂蛋白的降解。(Hsiao, Fong, Tzu, Lin, Chou, amp; Sheun, 2004)。
商业上，类胡萝卜素被用作食品着色剂和营养补充剂，2005年全球市场估计产值为9亿3500万美元（MAROVA等，2012）。长期以来，植物提取物一直是植物类胡萝卜素的来源，特别是beta;-胡萝卜素和叶黄素。虽然植物仍然是天然产生类胡萝卜素的重要来源，但各种微生物过程已被商业化地用于生产此类化合物，主要是深层发酵。(Kaiser, Vallentin, amp; Fuhrmann, 2007)。丝状真菌、酵母菌、细菌和藻类，如链霉菌链霉菌、三胞布拉霉菌、藻菌、布氏杆菌、黄杆菌、茯苓和红酵母菌，都是产类胡萝卜素菌。(Choudhari, 2008; Yurkov et al., 2008; Ungureanu, Marchal, Chirvase, amp; Foucault, 2013)。
固态发酵（SSF）允许结构更紧凑的反应器，减少能量和水的消耗，降低对环境的影响(Orzua et al., 2009; Rodriguez- Duran, Contreras-Esquivel, Rodriguez, Prado-Barragan, amp; Aguilar, 2011)。大量的研究已经证明了用低成本底物生产类胡萝卜素的可行性，例如米糠(Roadjanakamolson, 2010)，甘蔗渣和玉米淀粉水解液 (Buzzini amp; Martini, 2000)。为了利用所选菌株的微生物发酵潜力，确定最佳培养基和环境条件是必要的(Bhosale amp; Gadre, 2000b)。然而，对固态发酵生产类胡萝卜素的研究很少，作为现代生物过程的优势还没有被探索。本研究的主要目标是以固态培养和聚氨酯泡沫为载体，用柱状生物反应器填充培养基，研究几种培养条件对红酵母菌YB-252产生类胡萝卜素的影响。
2 材料和方法
2.1 试剂
所有使用的试剂均为分析级，得自Sigma Aldrichsreg; Mexico。此外，使用了标准的番茄红素（Sigma Aldrichsreg; Mexico）和beta;-胡萝卜素（GNCreg;）。
2.2 微生物
来自微生物DIA-UAdeC集合的红酵母菌YB-252获得自美国农业部（USDA），保存冻干直至使用。为了再活化，细胞接种于麦芽糖酵母提取物培养基（YM），配方如下（g/L）：葡萄糖10，麦芽糖3，酵母提取物3和蛋白聚糖5，并且在30℃培养48h。
2.3 咪唑对类胡萝卜素产物的影响
评价了beta;-胡萝卜素生物合成代谢调节剂浓度的影响，在装有50ml无菌的麦芽糖酵母提取物培养基的250ml锥形瓶中培养红酵母菌YB-252菌株。发酵在30℃下在旋转振荡器中以每分钟180转进行72小时。研究了咪唑在50ppm，125ppm，250ppm，375ppm和500ppm下的代谢调节剂的作用，还研究了在发酵0h，24h，48h和72h时添加咪唑的影响。
2.4 固态发酵条件
将聚氨酯泡沫（PUF）作为固态发酵的惰性载体。 使用齿形刀片研磨机（Pulvexmini 100s）将聚氨酯泡沫研磨通过20号筛。聚胺酯泡沫用热水洗两次，再用冷水洗一次，在60℃下干燥48小时。(Rodriguez-Duran et al.,2011)。以麦芽糖酵母提取物浆为底物的培养基含有咪唑作为产物番茄红素的诱导剂，发酵在柱生物反应器（直径24mm、高度18mm）中进行。
2.5 评价类胡萝卜素生成的因素
使用Praytt-Burman设计来评价pH值、水分、碳源、接种浓度、时间、培养箱温度和使用的诱导剂浓度的影响。表1展示了设计变量的级别。评估了八个变量，每个重复三次。
2.6 类胡萝卜素的提取和定量
用蒸馏水洗涤聚胺酯泡沫并在真空下过滤以分离生物质和类胡萝卜素。使用改进过的Taskin,Sisman,Erdal,和Kurbanoglu (2011)报道过的方法来提取类胡萝卜素。将滤液以8800g离心15分钟，弃去上清液并回收细胞沉淀物。随后加入二甲基亚砜（DMSO）用于细胞壁破碎，将混合物在60℃加热30分钟，同时进行周期性涡旋均化。然后用丙酮处理混合物，涡旋并离心。通过分光光度法在480nm的波长下定量总类胡萝卜素浓度。通过HPLC检测番茄红素和beta;-胡萝卜素的存在。
2.7 固态发酵生产类胡萝卜素的动力学
对于生物过程的动力学参数计算，Verhulst-Pearl（1），Pirt（2）和Luedeking-Piret（3）的方程分别构建酵母生长、底物消耗和番茄红素生产的模型。
(1)
其中Xmax是生物量（g / gPUF），c是生物量和初始生物量的差异，e是实验误差（参见方程（4）），t是发酵时间。
(2)
其中S0是初始底物浓度(g/L)，m是常数，YX/S参见方程(5)。
(3)
其中P0是在FES的初始时间产生的番茄红素，YP / x是产物和生物量（g / gPUF）与mu;之间的相关性（参见方程（4））。
使用以下等式计算酵母生长、番茄红素产生和固态发酵的底物消耗的动力学参数：
(4)
其中mu;max是在指数生长期（h1）期间获得的比生长速率，dX / dt是生长速率，X是生物量（g / gPUF）。
(5)
其中YX / s是基于底物消耗（g生物质/ g底物）的生长产率。
(6)
其中YP / s是基于底物消耗的番茄红素产量（mg番茄红素/ g底物）。
(7)
其中qs是特定的底物消耗速率（g底物/ g生物量）。
(8)
其中qp是特定的番茄红素生产率（mg番茄红素/ g生物量/ h）。
2.8 使用UV和HPLC-DAD测定番茄红素
对于番茄红素分析，通过紫外-可见分光光度计分析发酵提取物在470nm和HPLC（Pursuit XRsC18柱，150 4.6mm，5mu;m）。通过梯度测定HPLC分析，A相：甲醇，B相：丙酮75％和C相：丙酮95％，流速1.5ml / min。波长在460nm。购自Sigma-Aldrich（墨西哥）的番茄红素用作外标。
2.9 统计分析
所有分析均一式三份进行。使用Statistica 7软件分析Plackett-Burman设计的类胡萝卜素产生数据以鉴定变量具有统计学显着性的影响。
3 结果与讨论
3.1 类胡萝卜素生产中的重要因素
使用Plackett-Burman设计（图1）对每种处理获得的类胡萝卜素浓度的结果表明，处理6和8分别得到较高的浓度，分别为340和323 mg / /L。Bhosale和Gadre（2000a）使用了各种红酵母菌突变体，其总类胡萝卜素产量达到33mg /L。此外，Nasrabadi和Razavi（2011）报道了由深红酵母菌产生的浓度为267mg / L的类胡萝卜素。 生产中的这些变化可能是由于使用的菌株不同和发酵类型。评估了七个参数，并且发现调节剂浓度，发酵时间和系统中水分的百分比是对红酵母菌YB-252产生类胡萝卜素具有统计学显着影响的因子（图2）。
水分是固态发酵的关键因素。根据底物性质，最终产品类型和微生物需求确定适当的水平。它与水活性，对生长的影响和微生物的代谢活动有关（Pastrana，1996）。帕累托图显示，较高百分比的湿度促进酵母生长和色素的产生（图2）。此外，使用诱导剂来特异性生产类胡萝卜素对于颜料的生物合成非常有效。例如，如果在类胡萝卜素合成途径中抑制参与beta;-紫罗兰酮环形成的酶（环化酶），则发生番茄红素合成（Feofilova，Tereshina，Memorskaya，Dul#39;kin，＆Goncharov，2006））。 Choudhari（2008）评估了添加各种调节剂Blakeslea trispora以生产beta;-胡萝卜素和番茄红素，这些作者报告说，在浓度为500 ppm的咪唑，吡啶和哌啶时，番茄红素的浓度分别为115.15,198.07和269.99 mg / L ， 分别。此外，Loacute;pez-Nieto等（2004）使用600ppm的咪唑，获得100％的总类胡萝卜素产生的番茄红素。 Čertiacute;k，Adamechovaacute;和Guothovaacute;（2013）测试了4种毛霉菌株在谷类基质上生长的能力，作者报道了在添加葡萄糖的1kg发酵底物中最大产量为8.5mg的beta;-胡萝卜素。在该工作中使用的条件下，尽管使用其他产生类胡萝卜素的微生物，但是能够获得更高浓度的类胡萝卜素，并且还可以通过使用其他微生物引起不同浓度的诱导物。
这些产物在此之后保持不变。 Roadjanakamolson（2010）指出，使用米糠作为支持物的固体培养基中的红酵母菌在发酵144h时达到最大beta;-胡萝卜素产量。这些差异可能是由于所用的菌株以及所用的培养条件不同。
3.2 咪唑对类胡萝卜素产生的影响
番茄红素的特定生产可以通过添加抑制番茄红素-环化酶的作用的化合物来促进，番茄红素-环化酶负责链的末端环化以随后产生beta;-胡萝卜素。当评估咪唑的浓度（50-500ppm）时，通过在发酵24小时加入250ppm的咪唑获得最高浓度的番茄红素（6.82mg / L）（图3）。 在浓度（375和500ppm）下，在某些情况下由于微生物生长被抑制，微生物不能吸收咪唑。
3.3 动力学参数
一些报道表明，微生物如真菌，酵母和细菌产生色素，然而，很少有关于固态发酵中色素生产的研究。此外，番茄红素的特定生产是困难的，因为这种胡萝卜素是beta;-胡萝卜素和其他化合物合成中的前体。Choudhari，Laxmi和Singhal（2008）评估了刺激物和抑制剂对Blakeslea trispora N
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