H7N9流感病毒在中国的传播、分化和地方化外文翻译资料

 2022-12-29 11:12

H7N9流感病毒在中国的传播、分化和地方化

Tommy Tsan-Yuk Lam1,2,3*, Boping Zhou1*, Jia Wang2,3*, Yujuan Chai2,3*, Yongyi Shen2,3*, Xinchun Chen1*, Chi Ma2,3, Wenshan Hong2, Yin Chen4, Yanjun Zhang4, Lian Duan1,2,3, Peiwen Chen1,2, Junfei Jiang1,3, Yu Zhang2,3, Lifeng Li2,3,Leo Lit Man Poon1,3, Richard J. Webby5, David K. Smith2,3, Gabriel M. Leung3, Joseph S. M. Peiris1,3, Edward C. Holmes6, Yi Guan1,2,3amp;Huachen Zhu1,2,3

摘要

2013年出现的新型 H7N9禽流感病毒已经在中国引起了多起人感染个案，体现出了人畜共患性病原体可能造成的持续性威胁[1-2]。尽管华东地区的第一波 H7N9爆发被成功控制，但进入 2013年10月份以来，病毒又卷土重来，再次引发了人类感染的病例。有关 H7N9病毒是如何重现的，后续又将如何发展的问题，目前仍不清楚答案，但它显然有可能成为危害公众健康的长期威胁[3-7]。在本研究中，我们发现H7N9禽流感病毒已经从中国的东部扩散到了南方，并在鸡群里稳定传播，这导致病毒出现了多个区域性进化分支，以及多种不同的重组基因型。病毒反复从浙江省引入其他省份，以及活禽市场上广泛存在的H7N9病毒是人感染禽流感病毒案例不断发生的直接原因。H7N9流感病毒在地理分布上的急剧扩张，以及遗传多样性的快速增长，使得目前的疾病防控体系面临着直接挑战。我们的研究结果显示，H7N9禽流感病毒已经在中国出现了地方化流行，并有可能以类似于H5N1、H9N2禽流感病毒的模式，扩散到其他的地区[8-9]。

2013年底开始的第二轮H7N9疫情已经造成318例人感染，截止2014年9月12日死亡人数超过一百例[7]，是第一波的两倍多。在第一波疫情中广东没有报告是否有人感染，在第二波疫情中浙江报告的病例数最多[7]。我们在2013年10月到2014年7月对浙江、广东、江西、江苏和山东省的活禽市场（LPMS），在特定的时间或平时进行了流感监测（扩展数据表1和表2），以及在2013年12月到2014年4月对深圳的医院（广东）进行了监测，追踪了H7N9第二波爆发的传播和演变。

图1 |地图展示了在中国的采样点以及H7N9在活禽市场的分离率。绿色和红色圆圈分别表明各城市（n = 15）活禽市场中鸡咽拭子中的H7N9病毒阴性和阳性。每月的隔离率显示在右边。虚线表示难以获得样品的月份。缩写：JS，江苏；SH，上海；ZJ浙江；JX、江西；GD，广东。

在这五个省的十五个城市进行的主动监测发现，市场中鸡的口咽拭子中有493种H7N9病毒，平均分离率为3%（扩展数据表1和图1）。在江西和广东，从2465个鸡泄殖腔拭子样品中只分离出五种H7N9病毒，得到的分离率为0.2%。本次调查中没有从家鸭中分离出H7N9病毒（扩展数据表2）。这些发现强调，市场里的鸡主要通过口咽途径传播H7N9病毒引起H7N9爆发。在检测到H7N9病毒的七个城市中，有人报告了人类病例[3-7]。东莞（广东）的H7N9阳性率从3.2%（2013年12月）增加到8.6%（2014年2月）（扩展数据表1和图1）。我们在南昌（江西）和汕头（广东）的常规监测显示，这两个城市直到2014年2月为止都是H7N9病毒阴性。自那以后，到2014年7月为止每个月都能检测到H7N9病毒，南昌的分离率从2%到15.4%不等，汕头的从1%到7.5%不等（扩展数据表1）。2013年10月，在山东和江苏的六个城市中的活禽市场，我们通过采样没有发现H7N9病毒。

虽然氨基酸变化发生在HA中（扩展数据表4），但观察到的抗原差异有限（补充数据，补充讨论1.2）。与NA蛋白耐药相关的突变仅发生在少数人的分离株中（扩展数据表5），可能反映了对药物治疗的反应。人类和禽类分离株之间的一致性差异被限制在PB2残基627和701(扩展的数据表5，补充讨论1.3)，这是在禽类病毒进入哺乳动物宿主时经常出现的。

我们的研究表明，H7N9流感病毒已经分化成不同的分支，依靠鸡群传播到更广泛的地区。这可能发生在家禽运输的贸易路线附近，根据w2-b分支的本土化，又反映出高消费地区家禽出口有限。人类感染被报道大多是来自中国南部和东部[1–5,7,10,12]。根据最近在遥远的西北--新疆出[7]现H7N9感染的报道，说明H7N9病毒可能已经横穿了大半个中国。这种病毒在鸡身上不引起明显的症状[20]，以及只进行了有限的监控，这种病毒流行程度很可能会比我们所掌握的记录高，它有可能会在一个广阔的地区成为地方性动物病。鉴于现在的散播趋势，它将只是一个时间问题，这种病毒通过跨境贸易传出中国，就像以前的H5N1和H9N2亚型流感病毒[8,21]。

地方性H5N1与H9N2病毒，以及H7N9病毒，与其它在中国流感生态系统里的病毒基因重组，从而产生新变种，例如H10N8[22]，H10N6[23]，H5N8[24]，H5N6[25]和H7N6（这篇文章）。这种在中国扩张的流感病毒遗传多样性，意味着除非采取到位的有效控制措施，如永久关闭活禽市场，中央屠宰活禽，防止在疾病爆发期间地区与地区之间的家禽运输，以及依靠系统的监控。预计H7N9和其它病毒会持续存在，并导致大量严重的人感染。H7是唯一一种亚型，除了大流行的亚型，它已经在哺乳动物之间建立传播（马-1、H7N7）。因此，H7N9病毒很可能会出现人类大流行。

方法

活禽市场的流感监测和样品处理

在第二次H7N9疫情爆发期间，在浙江（2013年10月）、江苏（2013年10月）、山东（2013年10月）和广东（2013年12月和2014年2月）共13个城市的活禽市场进行流感病毒监测。在2013年10月至2014年7月期间，每周也从南昌（江西）和汕头（广东）的常规监测中收集了样本，并纳入这项研究（扩展数据表1和表2）。在活禽市场里，收集表面看似健康的鸡和鸭的口咽和泄殖腔拭子。在南昌市场的鸭子饲养区也收集到了粪便。

所有样本送到实验室进行进一步的处理之前，都是装在单独的含有抗生素的小瓶中，然后保存在冰块中。样品接种在9 - 11日龄的鸡胚中，在37℃的环境中保存48 小时，以评估流感病毒的存在。血凝素阳性分离株通过血凝素抑制使用一组事先准备的对照抗血清进一步亚型区分[13]。

深圳医院流感监测

自2013年12月起，在深圳接受急性抗生素治疗的急性肺炎患者中，在知情同意下进行流感监测。本研究经深圳市第三人民医院伦理委员会和深圳市卫生局批准。将从每个患者鼻、咽拭子和/或气管吸出物的标本装入运送培养液（基），并在两小时内送到诊断实验室。遵循世界卫生组织的指导方针，利用QIAamp病毒RNA Minikit(Qiagen)提取RNA，使用实时诊断RT-PCR检测H7N9流感病毒和季节性流感病毒的存在[27]。每个临床样本分别接种到9-10天的胚胎鸡卵和madin-darby犬肾(MDCK)细胞用于病毒隔离。整个基因组序列是通过病毒分离或直接从原始临床样本通过下一代测序获得的。

基因组测序

以血凝素抑制为基础，选择家禽H7阳性分离株进行测序。在每个取样场合，也选择3到5个h9阳性的分离物。对于H7N9阳性的人类样本，要不是我们不能获得病毒分离，就能使用临床标本进行全基因组测序。测序采用Roche 454 Genome Sequencer Junior，给予150times;流感基因组平均覆盖率，最初从454测序中读取的数据被组装为连续为40个核苷酸的重叠区域gt; 90% 的同一性，并使用Lasergene收集，版本9.0(http://www.dnastar.com)。样品中含有多个亚型的HA和NA基因，或有两个或更多相同的内部基因共享＜97%同一性的为混合感染。在所有其他情况下，基因中不和谐的碱基都被编码为简并的核苷酸特征。

序列比对与系统进化分析

在这项研究中产生的核苷酸序列，结合GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

Genbank）和GISAID（http://www.gisaid.org）数据库（完整的列表可以从http:// dx.doi.org/10.5061/dryad.5q7kf得到）所有公开可用的甲型流感病毒序列。序列使用MUSCLE v3.5[28]手动调整。有潜在的镶嵌图案[29]或过多的模糊碱基(基因长度大于0.5%)的序列被排除在排列之外。根据前面所述，根据每一个基因片段的全貌发展史，选择与H7N9有关的参考序列的一小部分与我们测定的序列[13]。然后，这些精炼的数据集在PhyML v3.0[30]中使用GTR I-4核苷酸替代模型估计最大似然进化史。用shimodairah - hasegawa近似似然比值判别法对系统遗传稳健性进行评价[31]。每个内部基因最大似然发展史在H9N2 HJ-ZJ/07子谱系中确定有大的分支(即分支1-3)。将这些分支进一步划分为子分支（如1.1、1.2、1.3、2.1等），满足以下条件：（1）它们至少含有三个H7N9序列；（2）它们的平均子分支遗传距离小于3%。发现第一波的H7N9病毒的主要分支为分支1.1。分支使用的数字与早期研究的一致[11]。

随时间与空间变化的进化推理

每个病毒对齐的H7、N9基因序列被串联起来(9个菌株被忽略，因为它们的H7和N9基因有不同的类群起源)。此外，剔除与H7N9序列距离较远的H9N2序列与同一采样场合的同一序列，因此，复杂的系统地理分析是可处理的。根据隔离日期与离散状态对序列进行编码，以此代表中国的抽样范围（上海，江苏，浙江，江西，广东，山东，和其他省份），亚型人口(H7N9与H9N2)，爆发的波次（第1波和第2波；仅限H7N9）。然后这些数据被用来推断H7N9病毒传播随时间与空间的变化，使用Bayesian Markov chain Monte Carlo (MCMC) 法，在BEAST package (版本1.8)[32]中实现，采用SRD06核苷酸替代模型[33]，一个不相关对数正态分布的松弛时钟模型[34]，一种具有时间感知平滑的Bayesian skyride coalescent 模型[35]，一个离散的非可逆的系统地理模型[36]。MCMC方法的多次计算和组合，为每一个数据集提供3.9~4.5times;108个步骤，每1500个步骤进行一次抽样。相关参数的收敛性用Tracer v1.5[37]评估。

基因突变

最大似然树每个内部节点的原始核苷酸序列，利用联合极大似然法在datamonkey服务器进行重构[38]。对每个树枝的根和尖端的序列进行了比较，所示的差异表示沿该分支发生的突变。

扩展数据表1 |在活禽市场监视表面健康的鸡

Province City Timeperiod Samples#

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Influenza

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H9dagger;

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Jiangsu

Suzhou

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