PARP1对DNA损伤的NAD 消耗引发了对受损细胞存活至关重要的代谢转移外文翻译资料

NAD consumption by PARP1 in response to DNA damage triggers metabolic shift critical for damaged cell survival

摘要：

DNA 损伤信号对于维持基因组完整性和细胞命运决定至关重要。聚 (ADP-核糖) 聚合酶 1 (PARP1) 是一种 DNA 损伤传感器，以损伤剂量和复杂性依赖性方式快速激活，在损伤部位的初始染色质组织和 DNA 修复途径选择中发挥关键作用。然而，我们对其在受损细胞中激活的全细胞后果的理解仍然有限。将相量方法用于荧光寿命成像显微镜和基于荧光的生物传感器与激光微辐照相结合，我们发现结合的 NADH 碎片在细胞范围内快速增加以响应核 DNA 损伤，这是由 PARP 依赖性 NAD 消耗触发的。这种变化与代谢平衡转变为氧化磷酸化 (oxphos) 而不是糖酵解有关。由于快速的 PARP 依赖性 ATP 剥夺，oxphos 的抑制而不是糖酵解导致 parthanatos，这表明 oxphos 对受损细胞的存活至关重要。结果揭示了通过细胞代谢变化对 PARP 激活的新型促存活反应，并证明了先进荧光成像和激光微辐照诱导的 DNA 损伤的独特应用在活细胞中如何成为以高时空分辨率询问损伤诱导的代谢变化的有力工具。

关键词：DNA损伤 NADH NAD

一、介绍

聚（ADP-核糖）聚合酶 1 (PARP1) 作为 DNA 损伤传感器，其酶活性被迅速激活以响应DNA 损伤（Gupte 等，2017）。 PARP1将氧化的 NAD(NAD ) 作为ADP（核糖基）化自身和各种靶蛋白质的底物。虽然最初被认为是一种碱基切除修复因子，现在已知PARP1参与多重DNA修复途径。损伤部位的快速聚（ADP-核糖）（PAR）积累通过各种染色质修饰剂的募集来控制损伤部位的可及性，并决定 DNA 修复途径选择（Ahel et al., 2009; Gottschalk et al., 2009; Sun et al., 2009; Bouwman et al., 2010; Chou et al., 2010; Larsen et al., 2010; Polo et al., 2010; Smeenk et al., 2010; Ball and Yokomori, 2011; Jaspers et al., 2013; Ayrapetov et al., 2014; Khoury-Haddad et al., 2014; Altmeyer et al., 2015; Izhar et al., 2015; Gupte et al., 2017）。我们还证明了 PARP1 激活抑制了 53BP1 向损伤部位的募集，为 PARP 抑制引起的 53BP1 和 NHEJ 依赖性细胞毒性提供了另一种解释(Cruz et al.,2016)。PARP除了促进有效修复，从而促进细胞存活，当过度活化时，PARP还被证明会影响新陈代谢并介导衰老和细胞死亡（细胞凋亡和坏死）(Gupte et al., 2017)。由于氧化和还原形式的 NAD（分别为 NAD 和 NADH）是对细胞能量产生至关重要的代谢辅因子（Heikal，2010），预计损伤诱导的 PARP 激活消耗 NAD 会阻碍细胞能量代谢。此外，据报道 PARP1 通过 PARylation 抑制己糖激酶 (HK)，这是糖酵解途径中的一种关键酶（(Andrabi et al., 2014; Fouquerel et al., 2014; Feng et al.,2015），导致ATP 剥夺和随后的细胞死亡称为 parthanatos（Andrabi et al., 2008）。Parthanatos 被证明需要来自线粒体的凋亡诱导因子(AIF)的PAR 依赖型核易位（(Fatokun et al., 2014），但 AIF独立型 parthanatos 也有报道（Jang et al., 2017）。此外，PARP 激活会导致细胞内酸化，这似乎会促进坏死（Affar et al., 2002）。 因此，PARP 激活的下游效应是复杂的，DNA 损伤剂量与影响能量代谢和/或触发细胞死亡的 PARP 信号强度之间的精确关系还没有很好地描述。

由于 NADH 是氧化还原（氧化还原）反应和 ATP 生成的重要辅助因子，因此多光子显微镜捕获 NADH 自发荧光和测量活细胞代谢动力学的技术，最近因其在从发育到癌症和衰老的研究中的广泛适用性而受到关注（Skala and Ramanujam, 2010; Stringari et al., 2012a,b）。 NADH 的游离状态和蛋白质结合状态分别反映糖酵解和氧化磷酸化 (oxphos)，可以使用荧光寿命成像显微镜 (FLIM) 进行区分（Schneckenburger et al., 2004; Skala et al., 2007a,b; Heikal, 2010; Georgakoudi and Quinn, 2012; Stringari et al., 2012a)。 FLIM 的主要挑战之一是剖析单个像素中不同荧光物种可能的寿命贡献所需的拟合程序。在我们的方法中，我们将无拟合相量方法应用于 FLIM 分析，该方法提供了每个像素处荧光衰减的图形表示（Digman et al., 2008）。 具有多个荧光团寿命贡献的像素可以解析为单个物种的线性组合。 此外，NADH 的绝对浓度可以使用 phasor-FLIM 方法（Ma et al., 2016）进行测量，该方法有望对 NAD 的变化做出敏感响应（Nakamura et al., 2003）。 这里，使用 phasor-FLIM 方法结合荧光生物传感器和激光微辐照，我们以高时空分辨率检查了响应于核限制性和常规 DNA 损伤的实时代谢变化，并测试了不同 PARP 信号对不同剂量/复杂性 DNA 损伤的贡献。使用这种综合方法，我们观察到在细胞核和细胞质中以PARP1的活动依赖的方式，NADH（与 NAD 的减少相关）和 ATP 的快速减少。有趣的是，PARP1 激活还引发了蛋白结合 NADH 种类相对于游离 NADH 的快速增加，这与 oxphos 超过糖酵解的净增加相关。重要的是，这种转变似乎反映了代谢增加受损细胞对 oxphos 的依赖性。oxphos 抑制剂，但不是糖酵解，特异性地使细胞对 DNA 损伤敏感，从而加剧了 ATP 剥夺，导致 PARP 依赖性、半胱天冬酶非依赖性细胞死亡。NAD 补充可以挽救对 oxphos 增加的依赖性，这表明它与 PAR 依赖性 HK 在糖酵解中的抑制作用不同。综上所述，FLIM 和荧光生物传感器的相量方法与激光微辐照相结合，提供了有价值的工具来捕获响应 DNA 损伤的代谢变化的高分辨率单细胞动力学，并揭示了 PARP1 消耗 NAD 的关键下游后果，促进细胞存活在DNA损伤的细胞中。

二、结果

FLIM 的相量方法揭示了应对 DNA 损伤时蛋白质结合NADH比游离 NADH 成比例增加。

使用激光微辐照，通过 FLIM 在 HeLa 细胞的细胞质和细胞核中测量 DNA 损伤诱导的 NADH 游离和结合部分的变化。激光微辐照可用于以高度可控的方式诱导 DNA 损伤（Kong et al., 2009, 2011; Gomez-Godinez et al., 2010; Silva et al., 2014; Cruz et al., 2016）。尤其是，近红外输入功率滴定(NIR) 激光允许差异DNA损伤诱导，从相对简单的链断裂到复杂的 DNA 损伤（即单链和双链断裂 [SSB 和 DSB]、胸腺嘧啶二聚体形成和碱基损伤），如先前报道的那样，具有不同的 H2AX 磷酸化（gamma;H2AX）和PARP 激活（补充图 S1A；参见图2A）（Kong et al., 2011; Cruz et al., 2016）。 在高输入功率下，复杂的 DNA 损伤会诱导泛核 gamma;H2AX（参见本文后面的图 2A），我们之前证明它依赖于 ATM 和 DNA-PK（Cruz et al., 2016）。在高输入功率下，复杂的 DNA 损伤会诱导泛核gamma;H2AX（参见本文后面的图 2A），我们之前证明它依赖于ATM和DNA-PK（Cruz et al., 2016）。类gamma;H2AX 扩散被观察到局部重离子辐射（Meyer et al., 2013）。在中等输入功率微照射后 24 小时，超过 90% 的细胞是存活的，而细胞实际上在低输入功率照射下恢复和增殖（补充图 S1B）。在高输入功率下，超过 70% 的受辐照细胞在 24 小时后仍然存活，并且存活的细胞在相间期停滞，并且在辐照后至少 60 小时内没有衰老迹象（补充图 S1、B 和 C）。

使用这些不同的激光输入功率，我们实时检查了核 DNA 损伤对细胞代谢的影响。在相量图上检测到像素簇，并根据荧光寿命对强度图像进行伪彩色（图 1、A 和 B）。我们还测量了 NADH 强度和浓度（Ma et al., 2016），它们在很大程度上具有可比性，以一种损伤剂量依赖性的方式（补充图 S2A）。细胞质 NADH 信号的主要来源是线粒体（图 1A，荧光强度）。使用 NAD 特异性生物传感器（Cambronne 等人，2016）比较线粒体和细胞质中的 NAD 也显示对 DNA 损伤的反应在很大程度上一致减少（补充图 S2C）。有趣的是，FLIM 分析显示，在损伤后的前 120 分钟内，细胞质和细胞核中的结合 NADH 部分与游离 NADH 的比例以损伤剂量依赖性方式增加（图 1、C 和 E）。除了瞬时 NADH 减少外，用烷基化 (MMS) 和氧化 (H2O2) 损伤剂处

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