新式芽孢杆菌BS-5的乳糖诱导木质纤维素分解酶系统及其在碱预处理玉米芯糖化中的应用外文翻译资料

 2022-08-07 02:08

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新式芽孢杆菌BS-5的乳糖诱导木质纤维素分解酶系统及其在碱预处理玉米芯糖化中的应用

摘要

在这次研究中，结合羧甲基纤维素琼脂平板，木聚糖琼脂平板和滤纸水解测定试验，一种新型纤维素酶和木聚糖酶生产菌株被成功分离，经鉴定为芽孢杆菌。使用乳糖作为唯一碳源时，一个完整且平衡的木质纤维素分解酶系统能够产生内切葡聚糖酶（9.6 U / ml），外切葡聚糖酶（0.8 U / ml），总纤维素酶（1.4 U / ml），木聚糖酶（3.8 U / ml）和beta;-葡糖苷酶（1.2U / ml）。有趣的是，粗培养上清液的酶图显示了多功能的木质纤维素分解酶系统，该系统包括至少四个分别具有21.2、23.8、28.9和31.2 kDa的内切葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性的键，表明这些酶可能是双功能的。更加令人满意的是，根据结合亲和力分析和扫描电子显微镜，由BS-5菌株产生的粗酶复合物不仅能够水解纯的不溶性多糖，而且还能够水解诸如玉米芯的农业残渣。在5％的底物浓度和20 FPU / g的酶负载下水解72小时后，碱预处理的玉米芯中减少的糖量为350.8 mg / g。这些结果表明，该菌株可能是开发更具成本效益和效率更高的木质纤维素分解酶混合物及木质纤维素生物质糖化的理想候选者。

关键词

芽孢杆菌，木质纤维素分解酶，乳糖，碱预处理玉米芯

实验背景

木质纤维素主要由纤维素和半纤维素组成，是地球上最丰富的可再生资源，每年生产1.5–1.7times;吨，因此是有前途的生物燃料和化学生产原料（Hadar，2013）。但是天然木质纤维素在结构和组成上较为复杂。为了将木质纤维素完全水解成简单的糖，需要一组包含不同底物特异性的纤维素酶和半纤维素酶协同作用才能实现。木质纤维素分解系统中的核心酶至少包括内切葡聚糖酶（EC 3.2.1.4），外切葡聚糖酶（EC3.2.1.9），beta;-葡萄糖苷酶（EC 3.3.1.21）和木聚糖酶（EC 3.2.1.8）（Liu et al. 2013）。此外，木质纤维素生物质的顽固特性要求高酶负荷才能有效降解。在这种情况下，目前木质纤维素分解酶的高成本是木质纤维素生物质经济生物转化的主要瓶颈(Hao et al. 2016; Duan et al. 2016)。根据Shrestha等人（2015），酶在玉米淀粉制乙醇成本中占4.5％，而在整个植物制乙醇成本中占17-20％。因此，迫切需要开发更有效的酶系统并降低酶的生产成本，以加快工业上利用植物生物质生产生物燃料的进展。

据报道，多种微生物可产生木质纤维素分解酶。其中，木霉属，曲霉属和青霉属的丝状真菌是商业木质纤维素分解酶的主要来源，里氏木霉是使用最广泛的酶(Mari et al. 2014)。然而，天然里氏木霉酶系统含有60–80％的外切葡聚糖酶，20–36％的内切葡聚糖酶和1％的beta;-葡萄糖苷酶，导致了纤维二糖的积累并且最终抑制了该酶的生产(Aftab and Patrick 2008)。Liao 等人分离了青霉菌GZ-2，该菌产生的内切葡聚糖酶和木聚糖酶活性分别为2.7和52 U / ml，而外切葡聚糖酶和总纤维素酶活性分别仅为0.12和0.65 U /ml (Liao et al. 2014)。使用纤维素结晶进行固态发酵，烟曲霉产生的内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶，总纤维素酶，beta;-葡萄糖苷酶和木聚糖酶的最大活性分别为240、15、9.7、470和2800（单位/ g干底物）(Soni et al. 2010)。大体上，尽管许多实验室做出了努力，但仍未生产出在商业上有效且平衡的酶复合物。一种能够产生更复杂和平衡的木质纤维素分解酶系统的菌株被标出，以降低木质纤维素生物转化的成本。近年来，细菌被广泛用作纤维素酶和半纤维素酶生产的高效来源。由于它们较高的生长速率，使得它们可以作为工业上重要的纤维素生物质转化酶的高效来源；更复杂的具有协同作用并有极高的自然多样性的糖苷水解酶能够产生高度稳定的酶。(Maki et al. 2009)。在细菌中，芽孢杆菌产生了多种工业上重要的胞外酶。如今，来自芽孢杆菌的商业酶约占酶市场的50％(van Dyk et al. 2009)。然而，一个相当普遍的观察结果是芽孢杆菌缺乏完整的纤维素酶系统，其主要活性源于内切葡聚糖酶和木聚糖酶，它们不水解纤维素结晶。(Anderson et al. 2013)。

降低酶的生产成本对于木质纤维素生产生物燃料的经济性也至关重要。需要找到廉价的能强烈诱导木质纤维素分解酶的碳源。大多数微生物的纤维素酶和半纤维素酶是可诱导的酶系统(Mari et al. 2014)。通常，植物细胞壁降解酶的常见诱导剂是不溶性底物，包括纤维素，半纤维素或植物体中聚合物的混合物。但是，使用不溶性底物来诱导酶的分泌对于工业过程而言并不理想，因为增加了搅拌负担并降低了氧气的传递效率。因此，选择便宜的可溶性诱导剂是提高酶生产和降低成本的有效策略。有趣的是，乳糖是奶酪制造和乳清加工行业的副产品，全球每年产生约120万吨乳糖，可以诱导某些真菌（例如硬皮假单胞菌和里氏木霉）中的纤维素酶形成。(Lo et al. 2010; Sehnem et al. 2006)。为此，它是唯一经济的可溶性碳源。根据Sadhu的第一报道，乳糖是细菌生产纤维素酶的良好诱导剂。(Sadhu et al. 2011)。但是，关于乳酸在芽孢杆菌产生纤维素酶和半纤维素酶的过程中作为诱导剂的报道很少。

在本次实验中，分离到具有多种木质纤维素分解活性的芽孢杆菌菌株，可以对木质纤维素进行生物转化，包括内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶，beta;-葡萄糖苷酶和木聚糖酶。并且研究了各种底物对细胞生长和酶产生的影响，尤其着重于乳糖的诱导。此外，通过分析酶谱图和水解产物来对木质纤维素分解酶进行系统表征。众所周知，利用木质纤维素生物质的半纤维素中存在的戊糖是降低生物乙醇生产成本的重要步骤。木质素含量低（asymp;10％）和碳水化合物含量高（asymp;70％）的玉米芯是用于生物燃料生产的木质纤维素生物质的重要来源。因此，该菌株分泌的酶复合物随后直接用于碱预处理的玉米芯的水解，来评估糖化效率。

材料

具有多种木质纤维素分解活性的微生物的分离与鉴定

从中国江苏省的水果种植园，蔬菜和谷物补丁中收集土壤样品。将少量土壤悬浮在无菌蒸馏水中，然后将100升所得悬浮液添加到液体培养基中，该液体培养基包含（/ l）：5 g羧甲基纤维素（CMC），5 g木聚糖，0.5 g胰蛋白，1.0 毫升玉米浆，1克KH2PO4、0.5克MgSO4·7H2O和1克NH4Cl。在35℃下进行富集培养48小时，然后将样品两次转移到新鲜的筛选培养基中。将富集培养物的样品稀释并铺在含有以下培养基（/ l）的平板上：10 g胰蛋白， 1 g KH2PO4，0.5 g MgSO4·7H2O和20 g琼脂。通过反复划线进一步纯化了生长中的菌落。在CMC或木聚糖琼脂平板上定性筛选了分离的菌株的纤维素酶和木聚糖酶产生，其中含有（/ l）：10 g CMC或木聚糖，10 g胰蛋白，15 ml玉米浆，1 g KH2PO4和0.5 g MgSO4·7H2O。筛选程序遵循Xu等人(2014)描述的方法。同时具有纤维素酶和木聚糖酶的菌株在包含（/ l）：的基本发酵培养基中培养：10 g CMC，10 g胰蛋白，15 ml玉米浆，1 g KH2PO4和0.5 g MgSO4·7H2O。在35°C下培养48小时后，将无细胞的上清液与5％（w / v）的Whatman滤纸混合，其中含有四环素（40 lg / ml）和环己酰亚胺（30 lg / ml），以防止任何微生物污染。然后，将混合物在40℃下培养48小时。选择可以解构滤纸的菌株进行进一步研究。通过BLAST分析16S rDNA序列鉴定出所选菌株。

不同底物诱导的酶活性

通过在35°C的碱性发酵培养基中培养分离出的菌株来评估各种碳源对细胞生长和产酶的影响。将10 g / l浓度的葡萄糖，半乳糖，木糖，蔗糖，纤维二糖，乳糖，木聚糖，CMC，米糠，玉米芯，玉米秸秆和滤纸分别添加到培养基中。在摇瓶中生长48小时后，如后所述估算酶活性和细胞生长。并且保留无碳源的对照组。

SDS和酶谱分析

根据Laemmli的方法进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）(1970)。将培养的上清液样品在上样缓冲液中于100°C加热1分钟，然后加到凝胶上。电泳后，按照van Dyk等人的方法检测分离条带的纤维素酶和木聚糖酶活性(2010)。

纤维素和半纤维素底物水解产物的分析

使用二氧化硅60F254板通过薄层色谱（TLC）分析来自纤维素和半纤维素底物的水解产物。将纤维素结晶，CMC，滤纸和木聚糖（5 g / l）与来自菌株BS-5的粗酶在40°C下培养。CMC和木聚糖的水解时间为6 h，而滤纸和纤维素结晶的水解时间为24 h。将水解产物的等体积上清液冻干，重悬，点样在TLC板上并风干。用1-丁醇：乙酸：水（3∶2∶1，v / v / v）将板显影两次。通过用乙醇/浓硫酸混合物（95：5，v / v）向平板喷雾并在121°C加热10分钟来检测碳水化合物。参考糖标准品包括葡萄糖（G1），纤维二糖（G2），纤维三糖（G3），纤维四糖（G4），木糖（X1），木糖（X2），木糖三糖（X3），木糖四糖（X4）和木糖戊糖（X5）。

制备不溶性木聚糖

为了制备经济有效的桦木木聚糖的不溶成分，将1 g木聚糖悬浮在20 ml水中，并在65°C下轻轻搅拌1 h。然后，将木聚糖以3000 rpm离心10分钟，并用水洗涤两次。将沉淀物在干燥器中干燥。

芽孢杆菌BS-5与木质纤维素底物酶复合物的结合测定

将纤维素结晶，玉米芯，不溶性木聚糖和Whatman滤纸作为结合基质。通过将菌株BS-5的培养上清液（5ml）加入0.2g结合基质中进行结合测定。将混合物在4°C下在反作用摇床中不断摇动培养。1小时后，通过离心（8000 rpm，10分钟）去除木质纤维素底物，并测定上清液中残留物的活性和未结合蛋白的量。所有测量至少重复三次。上清液中减少的活性和蛋白质可被认为是复合物的活性和酶。

扫描电子显微镜（SEM）

将玉米芯的不溶性木质纤维素生物质磨碎（40目），并在20°C下与20 FPU / g粗酶底物一起培养12小时。酶水解后，收集样品，洗涤几次并在真空下干燥。然后，通过SEM分析用粗酶处理的玉米芯颗粒的表面和内部结构。样品涂有金，并使用TM-3000分析仪进行了检查，电压为15-30 kV，放大倍数为2000。未处理的玉米芯用作对照，并且也通过SEM进行分析。

玉米芯的碱性预处理

将玉米芯晾干，在混合机中压碎并通过40目的筛子。然后，将玉米浓缩汁在锥形瓶中用NaOH（5％，w / v）进行固液比为1:15的预处理，在60°C下进行4 h。过滤预处理后的残留物，用蒸馏水洗涤至中性pH值并风干。根据国家可再生能源实验室的标准化方法，确定预处理前后的玉米芯成分(NREL, Golden, CO, USA)。原料玉米芯的组成分析表明，它含有36.7％的纤维素，34.4％的半纤维素和17.2％的木质素。碱预处理后，处理后残留物中的纤维素，半纤维素和木质素分别为44.8％，37.1％和10.2％。来自玉米芯的经处理残余物的产率为71.3％。

糖化实验

在含四环素（40 lg / ml）和环己酰亚胺（30 lg / ml）的50 mmol / l柠檬酸盐磷酸盐缓冲液（pH 4.8）中，以5％（w / v）浓度对碱预处理的玉米芯进行酶水解。加入相当于20 FPU / g底物的粗酶溶液，并在40℃下培养72小时。取出样品，并分析上清液中释放的还原糖。

分析方法

内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶，总纤维素酶和木聚糖酶的酶活性通过根据Crispen等人(2000)和Bailey等人(1992)的方法在与CMC，微晶纤维素，Whatman滤纸和木聚糖培养期间测量还原糖的量来确定。对于内切葡聚糖酶的测定，将1.5 ml的1％CMC和0.5 ml的粗酶溶液在40°C下反应30分钟，同时将底物和粗酶的混合物在相同温度下反应1 h，以测定外切葡聚糖酶，总纤维素酶和木聚糖酶。释放的还原糖的量通过二硝基水杨酸（DNS）方法确定(Miller 1959）。酶活性的一个单位定义为在指定的测定条件下每分钟产生1 mu;mol还原糖如葡萄糖或木糖所需的酶量。如先前所述，使用对硝基苯基beta;-D-吡喃葡萄糖苷（p-NPG）测定beta;-葡萄糖苷酶的活性(Jeya et al. 2010)。向反应混合物中添加2 mol / l Na2CO3后，在415 nm下测量释放的对硝基苯酚的量。酶活的单位定义为每分钟释放1 mu;mol对硝基苯酚的酶量。

结果与讨论

具有多种木质纤维素分解活性的细菌的分离和鉴定

最初通过使用CMC和木聚糖作为碳源的富集培养基选择了42个细菌菌株。使用刚果红过滤方法，这42种菌株中有9种出现在CMC平板和木聚糖平板上的透明区中。在这九个菌株中，根据其对Whatman滤纸降解的效率，选择了BS-5菌株进行进一步研究(图1)。将菌株BS-5的16S rDNA序列(GenBank accession EU 022584)通过BLAST在GenBank数据库中可获得的序列进行比较。BS-5的16S rDNA序列与芽孢杆菌LM4-2 (GenBank accession no. CP011101.1)，芽孢杆菌YP1 (GenBank accession no. CP010014.1)和谷草芽孢杆菌168 (GenBank accession no. NR 102783)的序列具有99％的同源性。分离的菌株进一步命名为芽孢杆菌BS-5，并存放在CCTCC（ID 208073）中。作为不溶性底物，Whatman滤纸通常用于测量总纤维素酶活性，该酶由三种酶活性组成：内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶和beta;-葡萄糖苷酶。在我们的研究中，芽孢杆菌BS-5的培养液能够水解Whatman滤纸和木聚糖。该结果表明，菌株BS-5能够产生完整的木质纤维

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