采用原位分离丁醇的方式提高菠萝叶木质素水解物发酵产丁醇的量外文翻译资料

 2023-04-05 08:04

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采用原位分离丁醇的方式提高菠萝叶木质素水解物发酵产丁醇的量

Rakesh Sajjanshettya、Neelkant S.Kulkarnia、Kumar Shankara、S.K.Jayalakshmib、Kuruba Sreeramulua,*

a印度卡纳塔克邦卡拉布拉吉古尔巴加大学生物化学系，585106

b印度卡拉布拉吉农业学院（农业科学大学-雷丘尔分校），585106

文章信息

【关键词】菠萝叶 鞘氨醇杆菌 糖化酶 丁醇 原位分离

【摘要】菠萝叶废料是一种能够产生丁醇的潜在生物活性物质。鞘氨醇杆菌ksn-11分泌的木质纤维素分解酶混合物，用于蒸汽预处理菠萝叶（100克）的糖化中，可在水解产物中生成可发酵糖（42.89克）和多酚。利用水解液中残留的玉米壳层选择性地去除多酚，并通过乙酰丁酸梭菌NCIM 2337进行发酵。通过向发酵培养基中添加组氨酸和脯氨酸（0.5%），乙酰丁醇梭菌NCIM 2337的丁醇耐受性和生产能力提高了1.8倍，并观察到丁醇产量增加（4.63 g/L）。为了将丁醇的亚抑制效应降至最低，通过Dowex L-493树脂进行原位产物回收，将丁醇产量（6.73 g/L）提高了2.6倍，最高产量达到0.16 g/g。这样以来，实现了丁醇生产的一步式优化工艺。

综述

矿物燃料的燃烧以及由此排放的温室气体不断污染着环境，这使得寻找一种可替代的燃料成为重中之重，这样的燃料应该具有成本效益、可再生和生态友好的属性。丁醇是一种比乙醇和甲醇的碳链更长的可替代燃料。它具有挥发性低、腐蚀性小、极性大、粘度大、能量含量高等优点，可以替代汽油，还可以与汽油和柴油以任意比例混合而不破坏现有的发动机系统(Birgen等，2019; Husin 等，2019; Upare等，2019)。丁醇是丙酮-丁醇-乙醇(ABE)厌氧发酵的传统产物。然而，ABE发酵经历了各种挑战，如底物可用性和成本、菌株潜力、加工步骤、产品抑制和集体最终产品(Kujawska等，2015)。为了保证成本的可行性，选择合适的原料是一个重要的因素。传统工业以农业废弃物为低成本原料，如稻秆、麦秆、玉米芯、甘蔗渣、糖类等(Birgen等，2019年)。果树行业在生物燃料生产和其他重要的化学品方面发挥着重要和可行的可再生资源的作用。印度是水果年产量第二大国家，产量可达4800万吨，平均占全球的12% (Khedkar等，2017)。其中，菠萝是印度产量和利用率最高的水果之一(Khedkar等，2017)。其菠萝年产量为130万吨，在世界中排名第七(Khedkar等人，2017年)。果实利用后的剩余物如叶、果皮、果核等可作为生产ABE的原料。菠萝叶(PL)含有纤维素(40-48%)、半纤维素(18-22%)、木质素(5-15%)、果胶(3-4%)和一些从灰烬中提取出来的物质(高达6%)(Chintagunta等人，2017)。木质纤维素生物质转化为生物燃料或其他重要的化工品的完整过程主要依赖于纤维素和半纤维素解聚释放可发酵糖。这一过程可以通过用不同的方法对生物质进行预处理来改变其结构。迄今为止，业界已经考虑将物理、化学和商用木质素分解酶作为生物质脱木质素的处理方法(Birgen等人，2019年)。化学物质的极端处理会导致抑制性化合物的释放，如木质素酚类、糠醛和少量弱酸，即甲酸和乙酸（Liao等人，2019年）。然而，醋酸等弱酸并不会抑制梭状芽孢杆菌的生长，但酚类和糠醛类对梭状芽孢杆菌的生长有负面影响，导致丁醇产量降低(Liao等人，2019)。因此，解毒是必要的，但它在经济上对工业是不可行的。因此，开发经济上可行的解毒过程是必要的。在本研究中，我们利用玉米壳水解残渣对多酚进行解毒。丁醇对梭状芽孢杆菌具有致命作用，丁醇产量低，在回收过程中消耗能量大。根据之前的报道(Xue等人，2016a, b)，梭状芽胞杆菌可以耐受2%的丁醇。因此，为了提高梭状芽胞杆菌的丁醇产量和耐受性，人们采用了化学诱变、基因重组和引入辅助因子等途径，通过维持膜的稳定性和生产稳定性，提高生物体的代谢活动和对丁醇的耐受性(Isar和Rangaswamy,2012;Nimbalkar等人，2019年;Xue等，2017)。据报道，芳香氨基酸、脯氨酸、组氨酸和谷氨酸在维持蛋白质结构、清除细胞内ROS的微生物细胞功能中发挥着重要作用(Mahipant等人，2017;Masion等人，1987年;Nimbalkar等人，2019年;Reeve 和Reid, 2016)。因此，它们作为抗氧化剂和渗透保护剂，能够耐受渗透性、氧化性和丁醇应激环境。所以这些氨基酸在发酵培养基中的存在可能有利于生物体提高丁醇耐受性。发酵培养基中丁醇的下游工艺生产能耗大，且产品收率低，可能混产丙酮、丁醇、乙醇(ABE)，经济上不可行。因此，为了降低成本，人们研究了几种方法，包括原位产品回收(ISPR)方法：液-液萃取、吸附、气体汽提和渗透汽化(Cai 等人，2018;Wei等人2011)。在这之中，吸附是最有前途、最可行、最容易处理的，它的能耗最低、能够最大程度降低丁醇的毒性作用、增加产量(Hijosa-Valsero 等人，2020;尼尔森和普拉瑟，2009年)。从ABE发酵培养基中分离丁醇的吸附剂多采用活性炭、沸石和聚合树脂(Xue等人，2016a, b)。优质的吸附剂具备价格低廉、特异性高、吸附能力强、化学、机械和热稳定性好、可重复使用的特点。根据Gao和Rehmann(2016)和Xue等人(2016a, b)的研究，从聚苯乙烯-co-二乙烯基苯中提取的树脂Dowex Optipore L-493、SD-2、M43和Diaion HP-2对丁醇具有最高的亲和力和吸附能力。因此，本研究的目的是利用蒸煮预处理的菠萝叶，通过混合由Sphingobacterium sp. ksn-11产生的粗木质纤维素酶水解，释放出可发酵的糖。水解产物利用水解玉米壳渣进一步脱毒，然后由Clostridium acetobutylicum (NCIM 2337)发酵生成丁醇。此外，为了提高丁醇的产量和耐受性，在水解产物中添加组氨酸和脯氨酸，并通过Dowex Optipore L-493对丁醇进行原位回收。

材料和方法

2.1基质的制备

菠萝叶(PL)采自印度卡纳塔克邦古尔巴加当地的市场。将叶片彻底清洗以去除污垢，并将叶片上的灰尘层烘干以去除多余的水分，然后在研磨机中研磨至大小约为1-2毫米，并在室温下保存，以备进一步使用。

2.2菠萝叶的预处理

采用Shankar等人（2019）的改进方法对PL（100 g）进行预处理，即在1 L锥形烧瓶中取出干燥的PL（1-2毫米），用蒸馏水（1:5）湿润，并进行蒸汽蒸压（尺寸为300times;500 mm，容量为35 L，配有温度传感器的Sisco立式蒸压罐）。高压釜参数预设为温度121◦C，压力15 psi，时间40分钟，保持条件恒定，以便蒸汽水解生物质。等待压力回归正常，高压釜冷却至室温，然后用蒸馏水冲洗经过蒸汽预处理的PL并过滤。过滤后的固体颗粒在50℃下烘干24小时(KEMI，钦奈，印度)，即可于糖化(Khedkar等人，2018;Salleh等人，2019)。

2.3预处理菠萝叶的酶促糖化研究

鞘氨醇杆菌ksn-11菌株生产木质纤维素分解酶的混合物是通过将1%的接种物接种在以10%玉米壳为碳源的最低盐培养基中，并在40℃下摇动（150 rpm）培养24小时来实现的。将培养基在4℃下以8000 g离心15分钟，以获得无细胞上清液，用作糖化过程中的酶混合物（Neelkant et al.，2019）。PL酶水解的优化参数来自于Shankar等人在2019年的报告。将粗酶混合物中50 mg（蛋白质浓度）的酶添加到pH值为7的预处理PL（10%w/v）中，并在培养箱（印度钦奈凯米）中以40℃的温度在通常手动摇动的情况下培养24小时。24小时后，水解物以10000 rpm， 4◦C离心10分钟以去除未水解的固体，上清液用作ABE生产的基质。蛋白质浓度由Lowry和Randall（1951）估算，总还原糖浓度由DNS（Miller，1959）估算。

2.4菠萝叶糖化水解液中多酚的分离

根据我们之前的研究（Neelkant等人，2019年）进行多酚分离，其中酶解玉米壳残渣从培养基中分离出来，残渣被彻底清洗，以消除水解过程中产生的结合多酚。PL的糖化水解产物通过含有玉米壳残渣的柱。吸附的多酚类物质采用Folin-Denis的方法进行洗脱和估算（Georgrsquo;e等人，2005年）。

2.5培养复苏与种子培养准备

乙酰丁酸梭菌（NCIM 2337）来自印度浦那国家工业微生物中心。该菌株在强化梭菌培养基（RCM）中复苏，该培养基包括：葡萄糖5 g/L；牛肉提取物10g/L；蛋白胨10g/L；氯化钠5g/L；酵母提取物3 g/L；淀粉可溶性5g/L；乙酸钠3 g/L；L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L；瑞苏林0.001 g/L。使用0.1 N HCL/0.1 N NaOH将pH值调整至6.5plusmn;0.2。向培养基中注入氮气10分钟minus;15分钟以去除溶解氧，并在121℃下对培养基进行高压灭菌15分钟。培养物在37℃下培养24小时，用作发酵的种子培养物。

2.6丁醇发酵

发酵在250 mL锥形烧瓶中进行，其中含有50 mL PL水解物（每100 g PL 41.6 g糖浓度）。NH4Cl 1 g/L；磷酸二氢钾2.5克/升；K2HPO4 3 g/L；添加0.4 g/L硫酸镁，将pH值调节至6.5，接种5%梭菌，并在轨道摇瓶（ORBITEK-LJE，Scigenics Biotech，印度）中以180 rpm的速度在37℃下培养96 h。

菠萝叶水解液生产丁醇受到了不同的因素影响，诸如时间（0minus;96小时）、组氨酸（0.1%–1%）和脯氨酸（0.1%–1%）的浓度，这些可以通过使用美国的Design Expert 13 软件响应面法在发酵过程中优化。Box-Behnken工具设计了一组17次的实验运行，包括一些有效的自变量，它们具有显著的排列和组合，没有任何不妥之处。进行设计实验，并根据二阶二次模型考虑最大优选响应。

在所有上述操作中，要保持烧瓶的密封以及发酵的温度在37℃、180rpm之下。在厌氧条件下，用注射器抽取样品，并进行批量测定以分析溶剂和糖的浓度。。

2.7丁醇的吸附与解吸

Optipore L-493树脂可用于吸附发酵培养基中的产物。为了利用这一特性，在将pH值调节至6.5plusmn;0.2之前，将20 g/L活化的Dowex Optipore L-493树脂加入培养基中（Gao和Rehmann，2016）。以不含氨基酸和树脂的培养基作为对照。

丁醇的解吸根据Lin等人的方法（2012）进行。简单地说，就是将树脂通过Whatman滤纸过滤，用去离子水轻轻清洗，以去除粘附在表面的细胞。然后用25毫升80%甲醇与树脂搅拌12小时，分离液相，通过0.2mu;m尼龙膜过滤器过滤，并通过气相色谱检查。计算吸附在树脂（吸附剂）中的丁醇的初始和最终浓度的差异（薛等人，2016a，b）通过式（1）进行估算，如下所示：

q=(Ceq-Co)V/W （1）

式中，q=吸附的丁醇量，

V =溶液体积，

W =吸附剂质量，

Ceqamp; Co =初始和平衡时溶液中的丁醇浓度。

分配系数（Kr）表示吸附剂从水溶液中吸收丁醇的亲和力或潜力，可通过以下等式（2）确定：

Kr=q/Ceq （2）

计算了30℃时树脂的吸附等温线、 40◦C采用Langmuir模型，使用minitab进行最小二乘回归分析。

q=qmCeq/(K Ceq)

式中，q为比负荷，Ceq为丁醇在溶液中的平衡浓度，K（g/L）为朗缪尔系数，qm为树脂的最大吸附量。

2.8分析方法

采用Shimadzu高效液相色谱(10 ATVP)， X- Bridge酰胺柱(Waters, 4.6 times; 150 mm)，折射率检测器(RID)检测，流动相为乙腈:水(7:3)，流速为1 mL/min。

发酵过程中产生的酸（乙酸和丁酸）浓度的分析通过岛津HPLC进行评估，该HPLC配备了X-Select HSS T3柱（水，4.6times;150 mm）和紫外检测器，在环境温度下，以乙腈：水：o-磷酸（1:9，0.1%）为流动相，流速为1 mL/min，检测波长为210 nm无梯度洗脱。

发酵产物ABE（丙酮、丁醇和乙醇）用气相色谱法（安捷伦7890B GC系统）测定，并用火焰离子化检测器和DB-ALC柱测定。零级空气（400ml/min）和氢气（40ml/min）与氮气（25ml/min）的混合物用作载气。柱入口和检测器温度分别保持在180℃和280℃。喷油器初始温度保持在40℃，然后以20℃/min逐步升高。所有样品的进样量保持恒定为2mu;L。分析所需的所有标准品均从印度孟买Himedia chemicals采购。

结果与讨论

3.1预处理菠萝叶的酶法糖化和脱毒

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