大肠杆菌转化醋酸为β-石竹烯的研究外文翻译资料

 2022-08-07 03:08

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大肠杆菌转化醋酸为beta;-石竹烯的研究

摘要

背景：在好氧条件下，醋酸是大肠杆菌在发酵过程中产生的主要副产物。醋酸破坏跨膜pH梯度，对细胞生长不利。因此，如何降低醋酸的产量，并将其作为原料加以利用，引起了我们的兴趣。在本研究中，我们以醋酸为唯一碳源，利用工程大肠杆菌生产beta;-石竹烯，证明了操作的可行性。

结果：首先，在大肠杆菌中引入并筛选了3种不同来源的乙酰辅酶a合成酶，构建了一株高效利用乙酸的菌株。其次，建立醋酸转化beta;-石竹烯的工程菌，在大肠杆菌细胞中共表达乙酰辅酶a合成酶（ACS）、beta;-石竹烯合成酶（QHS1）和二磷酸香叶酯合成酶（GPPS2）。最后，为了进一步提高醋酸合成beta;-石竹烯的能力，将异源MVA途径引入到细胞中。此外，乙酰辅酶a合成酶（AACS）也在细胞中表达，增加前体乙酰辅酶a，从而导致beta;-石竹烯的增加。最终的转基因菌株YJM67在72h内可累积生物量达12.6g/L和1.05g/L，比产量为干细胞，醋酸转化为beta;-石竹烯的转化率达2.1%。beta;-石竹烯在乙酸中的产率也达到理论产率的5.6%左右。

结论：本研究利用工程大肠杆菌将乙酸转化为beta;-石竹烯，探索了beta;-石竹烯生物合成的新途径。这是大肠杆菌以醋酸为唯一碳源生产beta;-石竹烯的首次成功尝试。因此，我们为beta;-石竹烯的合成提供了一种新的代谢工程方式。

关键词：beta;-石竹烯，乙酸，MVA路径，E.大肠杆菌

背景

beta;-石竹烯是一种常见的倍半萜，广泛存在于植物中[1，2]，被认为是下一代飞机燃料的一种成分[3–5]。传统上，与其他倍半萜类化合物一样，从植物中提取和化学合成一直是大规模生产beta;-石竹烯的常用方法，但这两种方法都有各自的缺点。低浓度、低回收率[6，7]使beta;-石竹烯从植物中分离得到，既不可行又不经济。同时，该过程的复杂性、石油储量的减少以及日益严重的环境问题，促使我们关注微生物生产beta;-石竹烯，利用木质纤维素衍生的可再生葡萄糖。此外，与传统方法相比，微生物发酵法生产beta;-石竹烯具有环境友好、可持续发展等优点，有望成为一种很好的替代方法。

然而，尽管在微生物合成中具有上述优点，但也存在一些瓶颈限制了其应用。例如，在好氧条件下，醋酸（HAC）是高细胞密度发酵过程中产生的主要副产物。不幸的是，高浓度的HAC破坏跨膜pH梯度，不利于细胞生长。这会对内渗透压、重组蛋白合成和生物量形成产生负面影响[8，9]。另外，副产品HAC的生产也相应降低了碳的有效利用率和目标产品的收率。

在以前的研究中，醋酸被认为是生产生物燃料或生化燃料的原料，因为它可以从各种廉价来源产生。（1） 甲醇羰基化是生产HAC的有效方法[10]。（2）HAC是合成气发酵过程中的主要产物[11，12]和水解（酸或碱预处理[13]或木质纤维素生物质热解[14]的副产物。（3） 天然气或沼气中的甲烷可以转化为HAC [15]。（4） HAC也是有机废物厌氧消化的中间产物。[16] 弯曲隐球菌已被证明利用HAC作为主要的碳源来生产脂质[17–19]，一些梭状芽孢杆菌物种可以同时利用HAC和糖来合成醇或丁酸盐[20，21]。因此，加强大肠杆菌对HAC的吸收能力，可以减少HAC的有害影响，循环利用废弃的碳，提高碳向预期路径的通量。然而，利用HAC作为主要碳源生产beta;-石竹烯的大肠杆菌菌株的代谢工程研究却未见报道。

在本研究中，我们尝试以醋酸（HAC）为原料生产beta;-石竹烯。采用多步骤代谢工程策略（图1）提高HAC的利用能力，增加IPP、DMAPP、GPP和乙酰辅酶A等前体的供应，最终导致beta;-石竹烯产量的增加。最终的转基因菌株YJM67在补料分批发酵条件下培养72h，生物量和beta;-石竹烯产量分别达到12.6和1.05g/L，HAC转化为beta;-石竹烯的转化率达到2.1%，这是首次以HAC为唯一碳源，利用大肠杆菌生产beta;-石竹烯的成功尝试。因此，我们为beta;-石竹烯的合成提供了一种新的代谢工程工具。

图一：本研究采用MVA介导的途径生产beta;-石竹烯。基因符号及其编码的酶（黑箭头标记的基因均来自粪肠球菌，白箭头标记的基因均来自酿酒酵母，灰箭头标记的基因和黑色特征的基因均来自大冷杉或青蒿，以灰箭头和白色特征标记的基因是大肠杆菌中的固有基因。MVA途径中的酶：肠球菌的MvaE（乙酰辅酶A乙酰转移酶/HMG辅酶A还原酶）和MvaS（HMG辅酶A合成酶）；酿酒酵母的ERG12（甲戊酸激酶）、ERG8（磷酸甲戊酸激酶）、ERG19（甲戊酸焦磷酸脱羧酶）和IDI1（IPP异构酶）；大冷杉的geranyl二磷酸合成酶；青蒿beta;-石竹烯合酶（QHS1）；大肠杆菌IspA（GPP合酶/FPP合酶）。ACS，nphT7。MVA途径的中间体：A-CoA，乙酰CoA；AA-CoA，乙酰CoA；HMG-CoA，羟甲基戊二酰CoA；Mev-P，甲戊酸5-磷酸；Mev-PP，甲戊酸焦磷酸。异戊烯基焦磷酸；二甲基丙烯基焦磷酸；二磷酸甘油酯；二磷酸法尼酯。

结果和讨论

大肠杆菌HAC高效利用途径的构建

HAC被用作生产生物质、生物燃料和增值化学品的潜在基质。然而，大肠杆菌使用HAC进行生物量生长的能力有限。大肠杆菌利用HAC的代谢途径主要是通过AMP形成乙酰辅酶A合成酶（acs途径）和磷酸转氨酶/乙酸激酶（可逆的PTA-ACKA途径）[9，22]。在先前的研究中，已经证明在保持原有HAC途径的同时过度表达单个acs基因是在大肠杆菌中同化HAC的最佳策略[23，24]。优化途径效率的合适方法可能是使用来自不同生物体的基因[25]。本文研究了天然大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌LT2和巴氏醋杆菌的乙酰辅酶a合成酶对HAC在细胞生长中的作用。

因此，本文通过筛选ACS基因，构建了醋酸在大肠杆菌中的利用途径。将大肠杆菌ACSEC基因、鼠伤寒沙门氏菌LT2株ACSST基因和巴氏杆菌ACSAP基因分别克隆到质粒pCOLDuet-1中，形成质粒pYJM60、pYJM61和pYJM62。采用不同浓度醋酸钠的M9培养基，分别培养了pYJM60、pYJM61和pYJM62菌株YJM60、YJM61和YJM62。如图2所示，结果表明含有ACSAP基因的菌株在三个菌株中生长最快，也表明巴斯德菌的酶在乙酸转化为乙酰辅酶A方面最有效。

利用天然MEP途径从HAC合成beta;-石竹烯

由DXP或MVA途径产生的法尼基二磷酸（FPP）可被beta;-石竹烯合成酶催化成beta;-石竹烯[28，29页]。然而，由于缺乏beta;-石竹烯合成酶，大肠杆菌具有MEP途径，不能独立产生beta;-石竹烯。在本研究中，为了生产beta;-石竹烯，将优化后的青蒿QHS1基因与巴斯德菌ACSAP酶一起在工程大肠杆菌（YJM63，含pACY-QHS1/pCOL-ACSAP）中高表达。首先，在以乙酸盐为碳源的M9培养基中培养重组菌株YJM63，未检测到目标产物beta;-石竹烯。在葡萄糖浓度为2g/L的M9培养基中培养，可产生56plusmn;6mu;g/Lbeta;-石竹烯。在含有空载体pACYCDUet-1/pCOL-ACSAP的对照菌株中未检测到beta;-石竹烯的产生。在此基础上，利用天然MEP途径、A.annua的QHS1基因和A.pasteurianus的ACSAP基因，在大肠杆菌中成功地建立了以乙酸为碳源的beta;-石竹烯生物合成新途径。然而，整个代谢途径对beta;-石竹烯生产的有效性太低。主要原因可能是缺乏其他重要的前体物质，如DMAPP、IPP和GPP。

二磷酸香叶酯（GPP）是倍半萜生产的关键前体，由GPP合酶催化二磷酸二甲基烯丙酯和二磷酸异戊烯丙酯缩合而成[30]。为了增加GPP的供应，从而提高beta;-石竹烯的产量，本文将巨冷杉的GPP合成酶与QHS1和ACSAP基因在细胞内共表达，构建了含有pACY-QHS1-GPPS2/pCOL-ACSAP的工程菌YJM64（E.coli BL21（DE3））。根据气相色谱分析结果，在培养24小时后，大肠杆菌YJM64菌株产生了102plusmn;9mu;g/Lbeta;-石竹烯。结果表明，GPP合酶（GPPS）的异源表达有利于beta;-石竹烯的产生。这一发现与以往对alpha;-蒎烯和沙宾烯等萜类化合物的研究结果一致[31，32]。

MVA介导的醋酸丁香烯生物合成途径的建立

尽管利用天然MEP途径合成beta;-石竹烯的研究取得了一定的进展，但beta;-石竹烯的产量很低，不适合工业化应用。在以往的研究中，混合MVA途径已被证明对所有萜类化合物的前体DMAPP和IPP的生物合成是有效的。在此基础上，提出了以醋酸为碳源的beta;-石竹烯生产中MVA途径可能比MEP途径更有效的假设。

为了提高beta;-石竹烯的产量，将杂交MVA途径导入大肠杆菌中，并与一年生A.annua的QHS1、grandis的GPPS2和pasteurianus的ACSAP基因一起高表达。如预期的那样，重组菌株YJM66（pACY-mvaE-mvaS-QHS1-GPPS2/pTrc-Low/pCOL-ACSAP）携带杂合MVA途径，可积累8plusmn;0.75mg/Lbeta;-石竹烯，比未经杂合MVA途径的对照菌株YJM64（pACY-qhs1pps2/pCOL-ACSAP）高出约8倍。根据所得数据，可以更容易地得出结论：杂交MVA途径有利于beta;-石竹烯的生物合成。

AACS对乙酸酯生产beta;-石竹烯的影响

在最近的研究中，链霉菌CL190菌株的乙酰乙酰辅酶a合成酶（AACS）被证明催化乙酰辅酶a和丙二酰辅酶a的单一缩合形成乙酰辅酶a[35]。与乙酰乙酸乙酯CoA硫醇化酶（EC 2.3.1.9）不同，NphT7对乙酰乙酸乙酯不进行硫醇化试验，后者是通过两个乙酰CoA分子的可逆非脱羧缩合来合成乙酰乙酸乙酯CoA，且偏好乙酰乙酸乙酯CoA硫醇化而非乙酰乙酸乙酯CoA合成，由于NphT7催化的乙酰乙基辅酶A的合成本质上是一种有利于能量的反应，NphT7可能是一种在细胞内提供乙酰乙基辅酶A的理想酶[36]。

当AACS编码基因nphT7在大肠杆菌中与HMG-CoA合成酶基因和HMG-CoA还原酶基因结合表达时，工程菌株的甲羟戊酸产量比未表达nphT7的对照菌株高3.5倍[36]。基于这些发现，推测beta;-石竹烯产生菌中乙酰乙酰辅酶a合成酶（AACS）的过表达会提高beta;-石竹烯的产量。

为了进一步提高beta;-石竹烯的产量，在产beta;-石竹烯大肠杆菌YJM67（pACY-mvaE-mvaS-QHS1-GPPS2/pTrc-Low/pCOLACSAP-nphT7）中过度表达了AACS编码基因（nphT7）。以60mm乙酸酯为碳源，在M9培养基中培养24小时，beta;-石竹烯的产量达到22plusmn;1.8mg/L，是未表达nphT7基因的对照菌株YJM66的2.75倍（8plusmn;0.75mg/L）。结果表明，乙酰辅酶a合酶有助于提高细胞内乙酰辅酶a含量，从而提高beta;-石竹烯的产量。

氮源类型和浓度对beta;-石竹烯产量的影响

培养基中氮的来源在改善期望产物的生物合成方面起着重要作用[37，38]。为了研究有机氮源的类型和浓度对beta;-石竹烯产量的影响，选择了6种不同的有机氮源并进行了评价（图3a）。在尝试的有机氮补充剂中，Solarbio牛肉提取物的beta;-石竹烯产量显著高于其他有机氮源。

基于以上数据，工程菌YJM67生产beta;-石竹烯最适宜的氮源类型和浓度为5g/L的Solarbio牛肉提取物。

beta;-石竹烯的实验室批量生产

为了扩大HAC生产beta;-石竹烯的规模，采用pH耦合的HAC补料分批发酵法，将HAC逐步添加到发酵培养基中，在5L规模的实验室分批反应器中培养了我们最优化的菌株YJM67。根据摇瓶条件，最终工程菌YJM67以最小培养基加5g/L beaf提取物在5l规模的实验室间歇反应器中培养。如图4所示，生物量和beta;-石竹烯的产量基本上没有明显的滞后相，其最大浓度分别为72和1.05时达到12.6和1.05mu;g/L，具有1.15毫克mg·h·1克-1干细胞的特定生产力，HAC对beta;-石竹烯（革兰氏到革兰氏）的转化效率达到了。2.1%。beta;-石竹烯在该菌株HAC上的产率也达到了理论产率的5.6permil;（37.81permil;）。

这些结果表明，该工程菌在大规模生产beta;-石竹烯方面具有巨大的潜力。

结论

本文通过将乙酰辅酶a合成酶、乙酰辅酶a合成酶、beta;-石竹烯合成酶和杂合MVA途径组装在工程大肠杆菌中，构建了一条新的beta;-石竹烯生物合成途径。最终的转基因菌株YJM67在72h内可累积生物量达12.6和1.05g/L，HAc转化为beta;-石竹烯的转化率达2.1%。据我们所知，这是首次成功的尝试，在beta;-石竹烯生产的大肠杆菌使用HAc作为唯一的碳源。因此，我们开辟了一条利用HAc代替葡萄糖作为碳源生产beta;-石竹烯或其它生化物质和生物能源的途径。

方法

菌株、质粒和培养条件

表1列出了本研究中使用的所有菌株和质粒。E、 所有的克隆工作都使用了大肠杆菌DH5a。E、 利用大肠杆菌BL21（DE3）进行产物生物合成。在摇瓶或补料分批发酵条件下，用不同浓度乙酸钠、牛肉提取物5g/L的改良M9最小培养基培养beta;-石竹烯，M9最小培养基由Na2HPO4 6、KH2PO4 3、NH4Cl 1、NaCl 0.5、MgSO4 0.24g/L组成，必要时选用合适的抗生素以下列浓度加入培养基：氨苄西林（100微克/毫升）、卡那霉素（50微克/毫升）和氯霉素（34微克/毫升）。

质粒构建

以大肠杆菌（ACSEC，GenBank号ACB05066.1）基因组DNA为模板，通过PCR扩增，获得了其乙酰辅酶a合成酶基因的核苷酸序列。以质粒pGH为载体，Genray公司化学合成了鼠伤寒沙门菌LT2（ACSST，GenBank号AAL23099.1）和巴氏醋杆菌（ACSAP，GenBank号AKR48484.1）乙酰辅酶a合成酶基因的核苷酸序列。

以质粒pGH为载体，Genray公司化学合成了链霉菌CL190（nphT7，Gen

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