来源于灰粉菌Coprinopsis cinerea的新型几丁质酶(ChiEn1)的异源表达与表征及其在降解甲壳素中的协同作用外文翻译资料

 2022-08-08 09:08

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来源于灰粉菌Coprinopsis cinerea的新型几丁质酶(ChiEn1)的异源表达与表征及其在降解甲壳素中的协同作用

摘要：几丁质酶ChiEn1不水解不溶性几丁质，但对几丁质寡糖有水解和转糖基作用。有趣的是，添加ChiEn1使几丁质内切酶ChiIII水解几丁质粉末产生的还原糖量增加了105.0%，在这些释放的还原糖中 (GlcNAc)2的量增加了149.5%，而GlcNAc减少了10.3%。由ChiEn1和ChiIII同时处理的几丁质粉产品中GlcNAc的含量与ChiEn1处理的几丁质寡糖产品中GlcNAc的含量接近，而不同于ChiIII处理的结果。这些结果表明，几丁质聚合物首先被ChiIII降解为几丁质寡糖，然后由ChiEn1进一步降解为单体和二聚体，ChiEn1和ChiIII的协同作用参与了几丁质在胞壁自溶过程中的高效降解。ChiEn1的分子作用机理由结构模拟进行探讨。

关键词：Coprinopsis cinerea，几丁质，几丁质酶，水解作用，转糖基作用

介绍

几丁质是一种不溶于水、由单体N-乙酰氨基葡萄糖通过beta;-1,4糖苷键连接的多糖，是真菌细胞壁的主要组成成分。在一些生理过程中需要分解细胞壁，例如酵母的细胞分裂和分离，孢子萌发，尖端菌丝的生长和分支，丝状真菌的自溶以及担子菌子实体形态的变化，细胞壁中几丁质聚合物的不断变化，可以假定这些是由几丁质酶对几丁质聚合物的酶解作用。几丁质酶包括内切酶、外切酶和beta;-1,4糖苷水解酶。几丁质内切酶随机地将几丁质从聚合物链上的任意点降解成不同长度的几丁质寡糖；几丁质外切酶从几丁质的还原端和非还原端逐步释放几丁二糖；beta;-1,4糖苷水解酶促进终端的释放，使二糖分解成两个单体。

担子菌类coprinoid蘑菇子实体的自溶表现出一个显著的特征:成熟菌体的完全解体和液化，以有效地分散担子。成熟菌毛的解体和液化可能是由多种糖苷水解酶(如几丁质酶和葡聚糖酶)降解细胞壁引起的。常见的真菌细胞壁主要是由担子菌类的子实体,与beta;-1，3-葡聚糖 和beta;-1，6-交联的分支,几丁质和蛋白质,在一起形成一个较好的细胞壁结构。在真菌细胞壁的核心架构,甲壳素链连接到beta;-1,3/1,6葡聚糖的非还原性末端。因此，葡聚糖酶和几丁质酶可能参与了担子菌子实体的细胞壁自溶。最近，我们从中分离纯化了一组糖苷水解酶，包括beta;-1,3-葡萄糖苷酶，外切-beta;-1,3葡聚糖酶，内切beta;-1,3-葡聚糖酶，并部分纯化了提取自C. cinerea子实体绒毛中的beta;-葡糖苷酶；这些酶在子实体自溶过程中对灰质葡萄球菌细胞壁的beta;-1,3-葡聚糖骨架显示出高效率和协同的作用。我们还发现外切酶（ChiB1）基因和推定的III类内切几丁质酶（ChiIII）基因在Coprinopsis cinerea的八个预测的几丁质酶基因中占主导地位，并且它们的表达水平随着子实体的成熟而增加。我们从C. cinerea子实体的菌伞中纯化并鉴定了外切酶ChiB1，异源表达并鉴定了灰粉菌的重组几丁质酶ChiIII。我们发现，几丁质酶去除几丁质链可以释放beta;-1,3/ 1,6-葡聚糖分子促进细胞壁降解，与beta;-1,3葡聚糖酶协同作用，促进绒毛自溶。

在这项研究中，我们进一步报道了假定的几丁质内切酶（ChiEn1）的基因表达也随着子实体的成熟而增加。 几丁质酶ChiEn1的表征表明，ChiEn1与以前报道的内切几丁质酶ChiIII协同作用，有效水解不溶性几丁质聚合物，阐明了ChiEn1的胆甾醇降解细胞壁中的几丁质成分，从而自动分解了C. cinerea子实体。

材料和方法

化学品： 几丁质粉末，85％的脱乙酰基壳聚糖，羧甲基纤维素钠（CMC-Na），乙二醇壳聚糖，层粘连蛋白和（GlcNAc）1-3-pNP购自Sigma-Aldrich Co. LLC。 N-乙酰基氨基葡萄糖，几丁质二糖，几丁质三糖，几丁质四糖，几丁质戊糖，几丁质六糖和几丁质庚糖购自Elicityl Oligotech（法国）。 壳六糖盐酸盐购自Zzstandard Shanghai Zzbio Co.，Ltd.（中国）。胶体几丁质和乙二醇甲壳质由几丁质粉末制备，制备方法参考Sandhya等人和Li等人。

菌株，质粒和培养条件C.cinerea（5026 5172）ATCC 56838购自ATCC。 如Zhou等人所述培养子实体。巴斯德毕赤酵母GS115，表达载体pPICZalpha;A购自Invitrogen。

几丁质酶ChiEn1的克隆，表达和纯化。几丁质酶ChiEn1的序列是从NCBI的GenBank中C.cinereaokayama7＃130的基因组获得的（登录号：EAU81461）。使用Signal P 4.1服务器（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）分析信号肽。来源于C. cinerea的菌伞的子实体的全RNA的提取与纯化，从无-DNARNA合成cDNA，用正向引物AGAGAGGCTGAAGCTGAATTCATGGCCTACGTCCC TCGCG和反向引物TGTTCTAGGAGCTGGCGGCCCCCCCCC扩增 ChiEn1 的cDNA等参考Niu 等。chiEn1d的cDNA产物与质粒pPICZalpha;A的PCR产物分别用EcoR I和Not I消化，然后使用ClonExpressTM II /一步克隆试剂盒（诺唯赞，中国）连接生成质粒pPICZalpha;AChiEn1。如Niu等所述，用pPICZalpha;AChiEn1进行巴斯德毕赤酵母原生质球的转化和pPICZalpha;AChiEn1的转化子的筛选。

培养转化细胞，诱导重组ChiEn1的表达，以及重组蛋白ChiEn1的分离纯化参考Niu等人的描述。

重组酶的蛋白质分析。 通过SDS-PAGE分析纯化的ChiEn1的纯度和分子大小。以牛血清白蛋白为标准品，通过Bradford方法测量纯化的ChiEn1的蛋白质浓度。通过胰蛋白酶消化，从纯化的ChiEn1的部分肽片段的氨基酸序列。 如Zhou等人所述，使用超精密基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪（德国布鲁克·道尔顿公司）进行分析。

几丁质酶活性测定。使用3,5-二硝基水杨酸（DNS）方法分析通过ChiEn1从几丁质或相关多糖释放的N-乙酰氨基葡萄糖或还原糖的量。将体积为200mu;L的反应混合物（含50 mM NaAc-HAc（pH 5.0）中的2mu;MChiEn1和1％几丁质或相关多糖）在800 rpm下于37°C孵育4小时。孵育后，将反应混合物与200mu;LDNS试剂合并，在100°C加热15分钟，然后在冰上放置2分钟。离心后，测量上清液在520nm的吸光度。为了确定ChiEn1和ChiIII的协同作用，在50mMNaAc-HAc（pH5.0）中，将200mu;L等分试样的反应混合物等分试样包含1％几丁质粉末和1.0mu;MChiEn1，ChiIII，ChiEn1 ChiIII或热灭活的ChiEn1 ChiIII。为了确定温度对ChiEn1对糖基甲壳素的水解活性的影响，将反应混合物在10-90°C下温育，所有其他参数与上述参数相同。 pH值对ChiEn1对糖基甲壳素的水解活性的影响（如上所述），pH在3-9（使用50mM NaAc-HAc缓冲液（pH3.0-6.0），50mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液（pH6）的反应混合物中。 0-7.5）和50mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5-9.0））。为了确定ChiEn1的稳定性，首先将反应混合物（如上）在10-90°C或pH 6.0-9.0下在没有底物的情况下孵育1小时，然后与乙二醇甲壳素合并反应。为了确定金属离子或金属离子螯合剂EDTA对ChiEn1对乙二醇甲壳素的水解活性的影响，首先将ChiEn1与1mM所示金属盐或1mM或2mM EDTA在50mM NaAc-HAc（pH 5.0）中孵育。 在37°C下不存在底物的情况下保持1小时，然后与糖基壳多糖混合，在上述相同条件下反应. 一单位几丁质酶活性定义为释放还原糖的酶量，相当于每分钟1mu;molN-乙酰基-D-葡萄糖胺。

使用几丁质酶测定试剂盒（Sigma CS0980）分析了ChiEn1从几丁质寡糖的pNP衍生物释放的对硝基苯酚的量。 体积为100mu;L的反应混合物，其中含有0.067mu;MChiEn1和1 mg / mL的（GlcNAc）3-pNP，（GlcNAc）2-pNP或GlcNAc-pNP，经37℃于800 rpm孵育20分钟。 然后，将反应混合物与200mu;L终止溶液合并，并在405 nm处测量吸光度。 酶单位定义为每分钟从指示的底物中释放1.0mu;mol对硝基苯酚的所需要的酶量。 为了测定反应动力学，分析了含有0.022mu;M几丁质酶ChiEn1和不同浓度的（GlcNAc）3-pNP或（GlcNAc）2-pNP（0.125-3mg / mL）的反应混合物。 OriginPro 8 SR0（OriginLab公司，北安普敦，马萨诸塞州）用于对数据进行双曲线拟合并确定Km和Vmax。

本研究报告的所有上述测定均在三个独立的实验中一式三份进行。

超高压液相色谱分析。使用高效阴离子交换色谱—脉冲安培检测器，对于单独使用ChiEn1或与ChiIII一起从几丁质粉末中释放的产物进行分析，在200mu;L的反应混合物中，含有1％几丁质粉末和1.2mu;MChiEn1，ChiIII，ChiEn1 ChiIII或热灭活的ChiEn1 ChiIII将50 mM NaAc-HAc（pH 5.0）在37°C下孵育4 h，然后与100°C下的开水合并，最终体积为1 mL，并在100°C下加热10分钟以终止反应。为了通过ChiEn1对几丁质寡糖释放的产物进行HPAEC-PAD分析，在50 mM NaAc-HAc（pH 5.0）中，将20mu;L包含100 nmol几丁质寡糖和适量ChiEn1的反应混合物（详细信息请参见结果）在37°C下温育指定的时间，然后与100°C下的开水合并至1 mL的最终体积以停止反应。对于高效阴离子交换色谱—脉冲安培检测器，分析ChiEn1从几丁质寡糖的pNP衍生物释放的产物，其中100mu;L包含100nmol的反应混合物将（GlcNAc）3-pNP或（GlcNAc）2-pNP或GlcNAc-pNP和0.055mu;M的ChiEn1 50 mM NaAc-HAc（pH 5.0）在37°C下孵育15分钟，然后与开水（100最终体积为1 mL，以终止反应。离心和过滤后，将上述反应混合物上样并从配备有PA-1保护柱的CarboPac PA-1色谱柱（4times;250 mm，Dionex）上洗脱，该色谱柱配有940 专业 IC Vario系统和IC安培检测器（万通 ），如Niu等人所述。

对于TSKgel Amide-80 HPLC分析通过ChiEn1从几丁质寡糖释放的产物的端基结构，将50mu;L包含100 nmol几丁质寡糖和0.8mu;MChiEn1in50mMNaAc-HAc（pH5.0）的反应混合物在冰上孵育5分钟。 然后与冰冷的水混合至200mu;L。 过滤后，将反应混合物加载到TSK凝胶Amide 80色谱柱（4.6times;250 mm，Tosch）上，并在25°C下以0.8mL·min-1的流速在超纯水中用75％乙腈洗脱。 洗脱液中的几丁质寡糖通过210 nm处的UV吸光度进行检测，并通过Agilent 1100 HPLC系统（安捷伦）测量其峰面积进行定量。

转糖基化产物的MALDI-TOF MS分析。 通过质谱分析反应混合物中的转糖基化产物。 将来自反应混合物的1mu;L样品与2mu;L基质溶液（15 mg / mL 2,5-二羟基苯甲酸，在30％乙腈中）混合，并直接在目标板上浓缩，并立即用热风枪干燥。 使用超精密基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪（德国布鲁克·道尔顿公司）在弹性控制 4.1的控制下，使用无栅离子光学器件，获得了产品的MS光谱。 实验是在反射器模式下使用24 kV的加速电位进行的。

蛋白质序列分析。 使用NCBI的保守域数据库分析了ChiEn1中的保守域。使用MEGA v.6.06软件，通过邻居连接法基于几丁质酶蛋白的催化结构域氨基酸序列生成系统发育树。使用DNAMAN软件（版本7.212，Lynnon Corp.，魁北克，加拿大）对ChiEn1催化结构域氨基酸序列和其他几丁质酶催化结构域氨基酸序列进行比对，以确定其序列同一性。

蛋白质结构分析。 ChiEn1的三维模型结构是使用I-TASSER预测的。在I-TASSER生成的五个模型中，选择了C值最高的I-TASSER模型以进行进一步的精度分析，并通过TM-align进行识别。 （http://zhang.bioinformatics.ku.edu/

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