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新酶435-辛醇催化游离脂肪酸酯生成辛酯的动研究
Dept. of Chemical Technology, University of Calcutta, Kolkata 700009, India
发表于2015年9月11日的 Wiley 在线图书馆 wileyonlinelibrary.com
摘要：辛基酯可以代替矿物油作为生物剂的重要组分。研究了在无溶剂体系中，利用商品化脂肪酶 Novozyme 435对废食用油中游离脂肪酸(FFA)与辛醇的酯化反应进行了研究。结果表明，在所研究的浓度范围内，酯化反应符合乒乓双反应动力学，不受底物或产物的抑制。此外，还研究了 Novozyme 435在现有反应体系中的稳定性，测定了12次连续利用后 FFA 的活性和最终转化率。在7个反应周期内， Novozyme 435的酶活性几乎达到100% ，此后逐渐降低(5%)。通过研究评估的动力学参数将有助于设计从廉价生物质来源大规模生产辛基酯的反应器。酶的复用性数据可以进一步降低昂贵的酶消耗成本，促进大规模生产。美国化学工程师学会生物技术。31:1494-1499,2015
关键词: 酯化作用，Novozyme 435，酶动力学，乒乓双联，酶活性，游离脂肪酸
导言
酶是一类重要的生物分子，能够催化成千上万的化学反应。这些生物催化剂具有以下优点: 操作条件温和，能量消耗低，产物纯度高，环境友好。虽然大多数脂肪酶仍然使用可溶性形式，固定化脂肪酶正在越来越多地被使用，其中酶是局部化在一定的空间区域(在载体材料)。固定化脂肪酶保证了工艺过程的经济性，确保了酶的重复利用，产品污染最小。
任何生化反应动力学的全面知识不仅对于理解反应机理是必要的，而且对于设计大规模工业用途的反应器也是必要的。多底物反应可分为两类: 序贯三元配合物反应机理，所有底物在催化之前同时加入到酶中，并且存在一个复合酶底物中间体; 非序贯乒乓或双位移反应机理，其中底物在一个强制的过程中发生结合涉及到两个底物和两个产物时，称为乒乓双动力学机理。
一系列酯化反应动力学涉及多种底物已报告使用脂肪酶从不同来源。在研究猪胰脂肪酶在不同有机溶剂中与油酸和乙醇的酯化反应时，Hazarika 等人建立了具有酒精抑制的乒乓双向反应模型。在甲基叔丁基醚介质中，利用 Candida 商业固定化脂肪酶(Novozyme 435)将乙酰丙酸与正丁醇酯化合成乙酰丙酸正丁酯，Yadav 和 Borkar7建立了相似的模型。研究了假丝酵母在正己烷中催化丁酸和油酸与正丁醇和油醇的酯化反应。他们报道了该反应体系在两种底物上均遵循乒乓双竞争性抑制剂反应动力学。Maury 等9研究了 Burkholderia cepacia 脂肪酶催化酯化反应的动力学。他们也报告了反应遵循乒乓双双动力学与抑制从两个底物。另一方面，Basheer 等人在正己烷体系中用根霉脂肪酶对月桂酸和十二醇的酯化反应进行了研究，发现该反应动力学对月桂酸和十二醇的酯化反应没有抑制作用。在正己烷中，N435(Novozyme 435)在乙酮11中酯化脂肪酸与葡萄糖，9,10-二羟基硬脂酸与1- 辛醇在根茎明黑脂肪酶作用下酯化反应的动力学没有任何酶的抑制作用。
虽然大多数关于酶催化反应的研究都表明有机介质的使用，但是这些过程的商业化应用还存在许多差异。大量使用有机溶剂不仅阻碍了工艺的经济可行性(酶失活、产品回收费用高、能源消耗) ，而且还对环境造成毒性威胁。因此，无溶剂反应成为有机介质中反应的一种经济可行和环保的替代方法。有关工程的报告数目有限不使用有机溶剂的酶促酯化作用。
以植物油为基础的生物质替代不可再生和不环境友好的石油基润滑油，生物质合成技术正在日益受到重视。这种植物油可以被成功地改性，形成生物溶剂组分，包括化学反应，如酯交换反应，15烯烃化，16环氧化，17等。本文作者已经建立了以废食用油为原料酶促合成辛基酯作为潜在的生物溶剂组分的方法。18为了充分认识利用无溶剂的废食用油生产生物溶剂组分的巨大商业开发潜力，本文对固定化脂肪酸与辛醇的酯化反应动力学进行了广泛的研究。考察了传质阻力对反应体系的影响。这种特殊的生物化学反应的动力学研究将使我们能够评价关键的动力学参数，这反过来将有助于设计和扩大大规模酶催化合成生物溶剂的反应器。此外，还通过测定生物催化剂的活性，考察了其在本反应体系中的稳定性。该系统中酶的可复用性信息有助于降低大规模生产中昂贵的生物催化剂的成本。
实验
材料
18采用气相色谱仪(Agilent 6890，n. 05版，配有 FID 检测器)分析 FFA 的脂肪酸组成，发现其主要成分为油酸、棕榈酸、亚油酸、鱼油酸，还含有少量肉豆蔻酸和芥酸。从印度班加罗尔的 Novozymes South Asia pvt. ltd. 获得了 Candida 脂肪酶的催化剂 Novozyme 435(脂肪酶固定化大孔阴离子树脂)。1- 辛醇(99% 纯度)来源于默克公司。所有用于分析的其他化学品都是从默克公司购买的分析级别的化学品。
生物催化剂的表征
为了估计 N435的物理性质，人们进行了不同的角色塑造测试。数据已在表1中报告。平均粒径由英国马尔文仪器公司 Mastersizer 2000测量。采用标准 BET 法测定了催化剂的比表面积和平均孔径。
酶435的性质
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物理形态 |
球形不透明珠 |
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平均粒径（厘米） |
0.042 |
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平均表面积 |
760000 |
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孔隙率 |
0.43 |
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平均孔径 |
230 |
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曲折性 |
5.3 |
酯化反应
N435催化 FFA 与辛醇的酯化反应是在作者先前完成的工作之后在反应器中进行的。温度、酶用量、搅拌速度分别保持在608C、5 wt% FFA 和400rpm。250rpm 的转化率可以满足酯类的转化率，因此被选用于所有的合成反应。但在测定反应动力学时，搅拌速度得到提高，完全消除了外部传质限制(详细讨论后)。除非另有说明，所有实验在上述操作条件下一式三份进行。
酶的重复使用性
研究了 N435(连续使用12个循环)在最佳条件下(温度5608c，酶量5wt% FFA，辛醇摩尔比52.5:1，搅拌速度5250rpm，时间53h)的酶活性。每次运行前后测定酶活性。首先用0.02 n KOH 滴定法测定酸与醇混合物中游离脂肪酸的酸值，然后加入酶进行测定。最后，在反应3h 后测定了游离脂肪酸的消耗量。所有酶活性测定一式三份。N435的相对活性定义为每个循环获得的 FFA 含量与第一个循环获得的 FFA 含量的比值。计算 FFA 含量的测定是在 Von der Haar 等人的工作之后完成的
酶再生
在每个酯化周期之后，生物催化剂通过过滤从反应介质中被小心地分离出来。然后用15ml 的庚烷洗涤酶珠，并在408C 的烘箱中烘干1h。回收的酶在干燥器中保存24小时，然后用于下一个循环。
动力学研究
通过考察不同底物浓度(FFA 和催化剂用量对酯化反应动力学的影响，研究了酯化反应动力学
图1. 间歇反应器中辛酯形成的初始速率与搅拌速度的函数关系
结果及讨论
传质行为
研究非均相催化反应的主要限制是在化学反应过程中可能出现扩散传质阻力的侵入，从而使系统运行不经济。在考虑实验条件下，N435催化脂肪酸与辛醇的酯化反应是否受动力学控制，对外扩散传质阻力和内扩散传质阻力的测定至关重要。当使用固定化酶时，为了接触到酶分子，反应物必须首先从液体扩散到催化剂颗粒的表面，穿过一个不流动的液体层，然后进入其孔隙，在那里酶被固定。这样的外膜层障碍在间歇反应器中，通过提高搅拌速度可以减轻外部传质限制。
很明显，350rpm后反应速率没有明显的变化。因此，为了确保 FFA 与辛醇的绝对混合和 N435在散装液体中的完全分散，批量动力学研究标准化了400rpm。因此，外部传质阻力被认为是微不足道的。
固定化酶珠的内部传质阻力受微球大小、颗粒孔隙率和载体材料极性等因素的影响。23,24 内传质的作用抵抗-通过估计对本系统中的ACE进行了评价的魏斯-普拉特准则，CWP,25由，
溶剂负荷(mol g21 s21) ，qc 为催化剂的体积密度(g cm23) ，Rp 为催化剂颗粒的平均半径(cm) ，De 为催化剂裂解孔内的有效扩散系数(cm2 s21) ，ca0为 FFA 的浓度(mol L21)
其中以反应物体积(mol L21 s21)为比反应速率，m 为反应相体积(l) ，w 为催化剂质量(g)。利用表1中的孔隙率(e)和曲折率(s)值，采用公式 De，cm2 s21测定有效扩散率
其中，DFFA2Oct 是 FFA 在辛醇中的分子扩散系数(cm2s21) ，用 Wilke-Chang 方
其中无量纲和 MOct (g mol21)是辛醇的反应因子和分子量，t (k)是绝对温度，l (g cm21 s21)是溶液的粘度，VFFA (cm3 mol21)是 FFA 的摩尔体积。DFFA2Oct 值为1.1431022 cm2 s21，De 值为9.2531024 cm2 s21。随后，Weisz-Prater 参数被确定为1.7231024。CWP 1，表明内部传质阻力对总反应动力学没有影响。25,28因此，外部和内部传质阻力对观察到的脂肪酸酯化反应速率的影响被发现是微不足道的，从而使它成为一个完全的动力学控制反应。
动力学模型
图2描述了当FFA浓度保持不变时，不同辛醇浓度对酯化反应速率的影响。 同样，图3显示了不同FFA水平下辛醇浓度的函数反应速率。 在这两种情况下，反应速率随着底物浓度的增加而增加。 这些图（图2和图3）是酶动力学的特征，在所研究的浓度范围内不受两种底物或其产物酯的明显抑制。
用底物浓度随时间变化的初级图计算的反应速率来构造Lineweaver-Burk或双倒数图（图4）。 1/Vo根据FFA浓度的倒数绘制在各种固定的辛醇浓度，其中Vo 表示伊尼-TiAl反应速率(molL21 g21 h21)。 一组平行台词得到了一种乒乓球双bi机制的 酯化无明显抑制的研究的浓度范围。24 N435与FFA反应表格
图2。 在不同辛醇浓度下，酶促酯化反应速率随FFA含量的变化而变化。
图3。 在不同的FFA浓度下，酶促酯化反应速率随辛醇含量的变化而变化。
图4。 Lineweaver-Burk对FFA和辛醇酶促酯化反应速率与游离脂肪酸浓度的双倒数图。
N435-FFA复合物。 随后，释放一摩尔水作为第一个产物形成酰基-N435中间体（修饰酶）。 然后，该中间体与辛醇反应生成相应的辛酯，在末端设置无酶（方案1）。 相应地，从下面的表达式中得到了相关的动力学参数
其中，kmeth;ffawwe和kmeth;oct哪里分别是相对于ffa和辛醇的michaelis-mentenconstantsvmax是最大的酯化率ffa和辛醇代表ffa和辛醇的初始浓度。图4的平行线的斜率与辛醇浓度无关，产生平均值km(ffa)/vmax为72.58gh的y轴截获量，当图4与辛醇浓度的倒数作图时，产生一个次要图(图5)，其斜率为50.46gh(km(oct)/vmax)，y轴截获量为24.41lgh(1/vmax)。其它动力学参数值如下:km(ffa)51.08moll21，km(oct)52.07moll21，vmax50.041moll21g21h21。对ffa和辛醇的km值表明，n435对两种底物具有相当的亲和力，因此在所研究的浓度范围内没有明显的酶抑制作用。在另一项月桂酸和十二醇的酯化反应中，作者还报道了棕榈酸脂肪酶对两种底物(kmla510.6mmoll21和kmdoh511.9mmoll21)的结合亲和力。10awang等12在研究棕榈基脂肪酶9,10-二羟基硬脂酸(dhsa)和1-辛醇的酯化反应动力学时，也发现了相似的固定化棕榈酸脂肪酶对两种底物的结合亲和力。他们报道dhsa和1-辛醇的km分别为1.3moll21和0.7moll21。但是，gofferje等人发现脂氧酶对甘油的亲和力比对油酸的亲和力(kmoh50.03moll21和kmcooh50.2moll21)高近7倍，因此该系统被酰基受体抑制。
酶435的稳定性
酶的重复使用对反应的经济可行性至关重要。因此，n435可重用性研究进行了多达12个周期的当前反应体系(在前面描述的酯化条件18)。如图6所示，酶活性在前7个循环中几乎保持100%。类似地，ffa转化为酯的转化率也保持在95%(最大转化率)。第8、9和10周期的酶活性
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