尿苷-胞苷激酶对尿苷和胞苷的磷酸化作用外文翻译资料

 2022-08-08 03:08

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尿苷-胞苷激酶对尿苷和胞苷的磷酸化作用

摘要

以重组尿苷胞苷激酶和醋酸激酶为原料，合成了5-单磷酸尿苷(5-UMP)和5-单磷酸胞苷(5-CMP)。将大肠杆菌K12的ACK和UCK基因以及保加利亚乳杆菌ATCC 11842的ACK1、ACK2和ACK基因克隆到质粒pET-28a中，构建了重组质粒。以鸟苷5-三磷酸(GTP)为磷酸中间体，经磷酸乙酯再生得到重组大肠杆菌。优化了几个参数的作用，包括底物浓度，GTP浓度，温度和反应pH。如果尿苷或胞苷被来自大肠杆菌的ACK编码的胞苷激酶和来自保加利亚乳杆菌的ACK编码的磷酸化酶，则可以实现高效率。在37°C和pH 7.5条件下，用30 mM尿苷/胞苷和0.5 mM GTP 共1ml 时，5-UMP和5-CMP的最大转化率为97%。另外，5-UMP和5-CMP产物在反应体系中非常稳定，没有经历明显的降解。

关键词:5-单磷酸尿苷，5-单磷酸胞苷，尿苷-胞苷激酶，醋酸激酶，GTP再生

1. 简介

核苷酸在食品、农业和医药方面有着重要的应用。5-单磷酸尿苷(5-UMP)和5-单磷酸胞苷(5-CMP)是制备多种核苷酸衍生物的关键中间体。5-UMP 是生产5-三磷酸尿苷(UTP)和糖核苷酸的原料。UTP通常用作核酸合成的前体，最近发现对肺和支气管有益。糖核苷酸被广泛用于合成寡糖糖。5-CMP是生产5-三磷酸胞苷和胞苷二磷酸胆碱的原料，这两种物质在一些国家都用于治疗脑损伤，尽管后者在其他国家仅被列为保健食品。

此外，5-UMP 和 5-CMP 都是嘧啶核苷酸，在某些特定的成人、婴儿和哺乳动物幼仔的免疫中发挥作用，是婴儿配方奶粉的重要组成部分。据信，这种类型的奶粉与母乳更相似。

综述了几种生产核苷或核苷的方法，包括微生物发酵、化学合成、RNA降解和核苷磷酸化等。用枯草杆菌发酵成功地生产了尿苷或胞苷，但不幸的是，除了Corynebac-terium ammoniagenes产生的5-磷酸肌苷外，其他核苷酸，如5-UMP和 5-CMP，由于核苷酸不分泌到培养基中，而且核苷酸代谢途径在细胞内受到严格控制，很少用细菌发酵生产。因此，在实验室或工业环境中首选的方法成为核苷酸的化学合成。根据已发表的大多数化学方法，三氯氧磷(POCl3)主要用作磷酸化试剂。一般来说，核苷在溶剂中溶解，核苷中的2,3-羟基必须受到化学保护。由于它们在酸性条件下的不稳定性，大多数核苷可以以除脱氧核苷以外的高产率被化学磷酸化。然而，POCl3和溶剂对工人有毒，而且不是环境友善的化学品。

核苷酸可以通过5-磷酸二酯酶从RNA降解中回收。这个过程似乎是环境友善的，产品主要用于婴儿配方奶粉。然而，从酵母中提取的RNA产生大量的废物，包括废水和细胞碎片，这些废物很难处理，而且会造成严重的污染。

利用Morganella morganii的核苷磷酸转移酶或大肠杆菌的酸性磷酸酶研究核苷酸的磷酸化，特别是肌苷或鸟苷的磷酸化，因为5-GMP和5-IMP是重要的风味增强剂然而，5-UMP和5-CMP尚未使用这些方法产生。

在这里，我们展示了一种新的生产 5-UMP/5-CMP 的方法，它是由尿苷-胞苷激酶(EC 2.7.1.48)磷酸化的尿苷/胞苷与醋酸激酶(EC 2.7.2.1)再生的GTP结合而来的(图 1)。磷酸化过程简单方便。它不仅无毒无污染，而且合成效率高，适用于工业生产。

尿苷胞苷激酶(Uridine-cytidine kinase，UCK)是一种在微生物、动物和人体中表达的酶该酶是核苷酸代谢挽救途径中的催化剂之一。它催化尿苷和胞苷磷酸化为UMP和CMP，这可以进一步磷酸化为UTP和CTP。这种酶没有用于工业生产5-UMP和5-CMP，但已发现它在活胞中许多其他嘧啶核苷的磷酸化中起关键作用，包括许多核苷类药物。

为了降低磷酸化的成本，通过 ACK 从较便宜的试剂乙酰磷酸盐再生 NTP。NTP 再生被其他研究人员广泛用于脱氧核苷酸的合成。

本研究分别从大肠杆菌K12和保加利亚乳杆菌ATCC 11842中克隆了UCK 和ACK基因。构建了几种重组大肠杆菌菌株, 它们都能够高效表达目的酶。以尿苷或胞苷为原料，在UCK催化下高效制备5-UMP或5-CMP，磷酸基取自磷酸乙酯经ACK再生的极少量GTP。

2. 材料和方法

2.1 菌株，质粒和化学试剂

UCK和ACK扩增模板由大肠杆菌K12编码，UCK1、UCK2和另一ACK-LB 扩增模板由保加利亚乳杆菌编码。用作表达载体pET-28a ( )的质粒购自 Invitrogen (Shanghai，China)。使用大肠杆菌 DH5 进行质粒扩增和保存，使用大肠杆菌 BL21(DE3)表达靶蛋白。两种菌株均购自天根生物技术有限公司(北京，中国)。所有内切核酸酶均购自 TaKaRa Biotechnology co. ltd. (Dalian China)。DNA 纯化试剂盒，Plasmid Mini 试剂盒和 Cycle-Pure 试剂盒购自 OMEGA BIO-TEK (中国上海)。先前由 Debbie c. Crans报道，在我们的实验室合成乙酰磷酸二钠(ACP-Na2)。核苷酸和核苷购自 Biocaxis Chemicals co. ltd. 所有其他化学试剂都可以在市面上买到。

2.2. 重组细菌的构建

用合成引物 PCR 扩增目的基因，并用适当的限制性内切酶消化(表 1)。然后，将消化的 PCR 产物转移到载体 pET-28a 中，产生重组质粒 p28U，pU1，pU2，p28A 和 p28A-l。表 2 列出了所有的质粒和重组菌株。

将重组质粒转化大肠杆菌 DH5。在每个基因测序后，将正确的质粒介质转化到大肠杆菌 BL21(DE3)中。产生重组菌株 D28U，DU1，DU2，D28A和DA-L (表 2)。所有菌株均在含卡那霉素(50 g/mL)的 Luria-Bertani (LB)培养液中培养，培养温度37°C，转速200 rpm。当 OD600达到0.6时，加入 50g/mL 异丙基beta;-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。然后将肉汤在37°C和200 rpm 下再温育4小时。离心(13,000times;g，2 min，4°C) ，每次收获培养液1.5 mL，在1.5 mL 100 mmol/l Tris-HCl 缓冲液(pH 7.0)中超声处理。将SDS-裂解缓冲液(5times;104 mu;L)与40 L细胞裂解液混合，在沸水浴中加热5 min，离心，样品上清液(15 L)用12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。蛋白质含量通过Bradford方法测定(Bradford，1976)。

2.4.5-UMP 或 5-CMP 的生物合成

将 30 mM尿苷或胞苷、0.5 mM GTP、45 mM ACP、3.315 U UCK、1.903 U ACK、10 mM Mg2 和 50 mM pH 7.5 的磷酸二氢钾缓冲液在37°C水浴中浸泡12 h。通过将混合物在沸水中温育2分钟来停止反应。然后，将反应溶液用双蒸馏水稀释50次。

2.5.分析方法

用 254nm 的紫外检测器通过 HPLC (Agilent 1200)分析稀释的反应样品。柱为 Hypersil SAX (5 m，4.6 mmtimes;250mm)，洗脱液流动相为50 mmol/L NH4H2 PO3(pH 4.5)。流量为1 mL/min。5-UMP或5-CMP在 35°C的保留时间分别为 4.3或4.0分钟。

3. 结果

3.1. 酶蛋白的表达

如图 2 所示，以含有 pET-28a ( )的大肠杆菌为对照，五种靶酶蛋白均以高产率高效表达。当使用 0.5 mM IPTG 作为诱导剂时，所有蛋白质在 37°C下可溶。目标蛋白的分子量符合预期: 23.5 kDa为UCK来自D28U (图2第2道) ，24 kda为UCK1来自DU1(图2第4道) ，23 kda为UCK2来自DU2(图2第6道)，43.2 kDa为ACK来自D28A (图2第8道)，43.5 kDa为ACK来自DA-L (图2第10道)。

3.2. UCK与ACK的GTP再生偶联的5-UMP或5-CMP的生物合成

UCK是一种嘧啶核糖核苷激酶，催化尿苷/胞苷磷酸化为相应的5- UMP或 5-CMP。在磷酸化过程中，使用NTP作为磷酸盐供体。由于NTP的高成本和低稳定性，使用了由ACKase催化的NTP再生过程。NDP产品形成于使用较便宜的化合物ACP再次将反应转化为NTP，由 ACK催化。在该过程中，将两种不同类型的UCK和ACK组合以催化5-UMP或5-CMP的合成。

如图3的a和b所示，UCK1的催化效率很差。UCK1与ACK或ACK-LB的所有组合产生的UMP/CMP转化率仅为 20%。UCK2的效率优于UCK1。转化率达到80-90%。但UCK的催化活性最高，转化率达到90% 。

根据我们以前的研究和文献，大肠杆菌的ACK能够再生NTP。然而，在这项研究中，发现来自保加利亚乳杆菌ATCC 11842的ACK在这种反应中更有效。当UCK和ACK-LB组合，5-UMP的反应速度明显快于其它酶组合。反应时间3小时后，5-UMP的最大转化率达到97%。还观察到胞苷磷酸化的类似结果。5-CMP的最大转化率达到97%以上，尽管这需要大约13小时。

3.3. 酶浓度对 UMP/CMP 转化率的影响

在特定的反应条件下，酶浓度对转化率和反应平衡影响不大，但可以影响反应速率。从图4的a看，当使用 3.315 U和1.903 U ACK时，5-UMP的转化率在 3 h内达到97%。同样，以胞苷为底物，加入3.315 U和1.903 U ACK，反应9 h 后5-CMP的最大转化率达到97% 。

比较图4的a和b，在相同条件下，虽然转化率相似，但尿苷的磷酸化 速度比胞苷快得多。另外，UMP和CMP产物在反应体系中非常稳定。在反应溶液中没有检测到显着降解和没有额外的磷酸化产物，如UDP或UTP。

3.4. 磷酸盐供体对 UMP/CMP 生产的影响

在活细胞中，由激酶催化的磷酸化反应需要 NTP作为能量。例如，在葡萄糖磷酸化过程中，ATP提供磷酸基团和生物能量转移到葡萄糖，产生6-磷酸葡萄糖。一般来说，ATP被认为是磷酸盐供体，尽管偶尔CTP参与脂质合成。

在我们的反应体系中，使用ATP、UTP或CTP作为磷酸供体是无效的，GTP 是最好的磷酸供体，如图5的a和b所示。反应3小时后UMP的转化率达到 97%，反应13小时后CMP产率也达到 97%。

3.5 GTP 浓度对5-UMP/CMP生产的影响

在实验过程中，在反应溶液中加入极少量的GTP。GTP是磷酸化所必需的(图 6) ，只有1 mM(1/30 起始浓度的尿苷或胞苷)或0.5 mM(1/60起始浓度的尿苷或胞苷)的GTP支持磷酸化反应。当用0.25 mM GTP (1/120 尿苷或胞苷初始浓度)时，5-UMP的转化率为83%，5-CMP的转化率仅为57%。因此，我们的反应体系对于5-UMP和5-CMP的合成是非常有效的。

3.6 底物浓度对生产的影响 5 -UMP/CMP

当尿苷的初始浓度为30 mM时，反应3小时后转化率为97% (图7)。类似地，当底物为30 mM胞苷时，反应13小时后转化率为97% (图7)。当底物浓度增加到35 mM和40 mM时，5-UMP的转化率分别为85%和82%，5-CMP的转化率分别为73%和56%。尽管反应时间增加，但产率不随底物浓度增加而增加。

3.7. 温度和 pH 值

如图8所示，在37°C时，尿苷和胞苷两种底物的转化率最高。尿苷磷酸化过程中pH值应维持在7.0~8.0之间，胞苷磷酸化过程中pH值应维持在7.5~8.0 之间。结果如图9所示。

4. 讨论

在这项研究中，设计了一个有效的生物合成生产5

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