从印度东北部受石油污染的土壤中分离到的枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌菌株的原油生物降解效率外文翻译资料

 2022-08-08 03:08

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从印度东北部受石油污染的土壤中分离到的枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌菌株的原油生物降解效率

摘要：比较了从印度东北部一个石油污染的土壤样品中分离到的枯草芽孢杆菌DM-04和铜绿假单胞菌M和NM菌株对土壤中石油粗烃的生物降解和摇动Xask研究的效率。

这些细菌菌株可以利用原油-石油烃作为碳和能量的唯一来源。 在实验结束时（120 d），铜绿假单胞菌M和NM菌群以及枯草芽孢杆菌菌株对TPH污染的微观世界的生物增强显示，与对照土壤相比，TPH含量显着降低。 铜绿假单胞菌菌株在降低培养基中TPH含量方面比枯草芽孢杆菌更为有效。 平板计数技术表明在富含石油和原油的土壤中外源播种细菌的表达生长和生物表面活性剂的产生。 结果表明，枯草芽孢杆菌DM-04和铜绿假单胞菌M和NM菌株可以有效地进行原位生物修复。

关键词：枯草芽孢杆菌； 生物降解； 生物修复； 生物表面活性剂； 聚芳烃（PAH）; 铜绿假单胞菌； 总石油烃（TPH）

  1. 引言

如今，油污事故已成为一种普遍现象，并引起了生态和社会灾难（Burger，1993； Burns等，1993； Shaw，1992）。除了对生态系统的意外污染之外，水油分离系统在污水处理厂中产生的大量油泥以及原油存储罐底部积聚的废油性材料也带来了严重的问题，因为许多用于净化土壤和地下水的标准处理工艺都有有限的应用，昂贵的价格或仅是部分有效的作用（Ferrari等，1996； Nicholas，1987； Vasudevan和Rajaram，2001）。因此，尽管进行了数十年的研究，成功地对石油烃污染的土壤进行生物修复仍然是一个挑战（Rahman等，2003）。

通过使用微生物来分解有害有机环境污染物的现场和现场处理过程都避免了经济和技术上的不利因素（Ahlert和Kosson，1983； Lee和Ward，1985）。 枯草芽孢杆菌DM-04和铜绿假单胞菌M和NM菌株是从印度东北部受石油污染的土壤样本中分离出来的（ONGC油焊缝），生长在大量碳氢化合物上，作为碳和能源的来源，证明了这些菌株可能 成为高效的烃降解剂（Das Mukherjee，2005年； Mukherjee和Das，2005年）。这些菌株是富含烃的培养基中生物表面活性剂的有效生产者。 有报道描述了外源添加的微生物生物表面活性剂在增强原生微生物对原油污染土壤的生物修复中的作用（Abalos等，2004； Cubitto等，2004）。

这项研究的目的是探讨和比较印度东北部原产的枯草芽孢杆菌DM-04和铜绿假单胞菌M和NM的嗜热菌株对原油的生物降解效率。

  1. 方法

2.1:化学药品

化学药品脂肪烃（辛烷，十二烷，十六烷，十八烷）和芳烃[py（PYR），菲（PHE）和蒽（ANT）]购自德国默克-舒查德。 丙酮和己烷购自印度的默克印度有限公司。标准脂族碳氢化合物购自美国Sigma–Aldrich。 原油和石油污染的土壤样品是从印度阿萨姆邦石油和天然气委员会（ONGC）油焊缝收集的。

2.2:微生物与培养

如先前所述（Das和Mukherjee，2005； Mukherjee和Das，2005），使用并维持枯草芽孢杆菌DM-04，铜绿假单胞菌M和NM菌株的菌株。

2.3:生物表面活性剂的分离

枯草芽孢杆菌DM-04和P.枯草芽孢杆菌的粗生物表面活性剂 通过无细胞发酵液的酸沉淀，然后用二氯甲烷或甲醇萃（Mukherjee和Das，2005），丙酮沉淀，然后用6.0 N HCl酸化（Das和Mukherjee，2005），分别分离出铜绿的M和NM菌株。如此获得的生物表面活性剂在真空中干燥，称重并以g / l无细胞培养液表示。

2.4:PAH对生物表面活性剂的增溶作用

如Barkay等人所述进行PAH增溶测定。（1999）。将BrieXy，以下0.6 g的ANT或6.0 g的PHE或PYR中的任何一种（从0.6 mg / ml丙酮中制得）分配到玻璃试管中（10毫米times;170毫米），并在操作的化学通风橱内保持打开状态去除溶剂，然后加入3.0 ml分析buVer（20 mM Tris–HCl，pH 7.0）和分级量的生物表面活性（125–500 g / ml），用于本研究中的各个细菌菌株。 将试管用塑料盖盖好，并在黑暗中于30°C摇动（200 rpm）下于垂直位置孵育过夜。通过1.2m Wlters（Whatman）对样品进行wlter处理，并在干净的试管中除去2.0ml的Wltrate，向其中加入2.0ml的己烷，然后通过涡旋2分钟进行萃取。 将该乳液以10,000 rpm离心10分钟以分离水相和己烷相。 用分光光度法（Hitachi U-2001）分别在PHE，ANT或PYR的252、250或273 nm下测量己烷提取物中的PAH。 从单个PAH（在己烷中）的校准曲线，确定每种PAH的浓度。 将含有生物表面活性剂但不含PAH的buVer含量相同的己烷萃取，并用作空白。 对照还平行进行，其中在用己烷萃取之前，没有生物表面活性剂添加到PAH中。

2.5:粗石油烃存在下细菌生长的测定

重复的分批培养物（nD3）在250 ml的锥形瓶中生长（100 ml的矿物盐培养基（Das and Mukherjee，2005），补充有原油（经测量和高压灭菌），Wnal浓度为2.0％（v / v））。对于铜绿假单胞菌M和NM菌株，在45°C温度和pH 7.0下孵育（Das和Mukherjee，2005）;对于枯草芽孢杆菌DM-04菌株，在55°C温度和pH 8.0下孵育（Mukherjee和Das，2005） ），并以200 rpm的速度旋转摇动。尽管这些细菌可以在很宽的温度（25–55°C）和pH（6.5–8.5）范围内生长，但是实验是在各个菌株的最佳生长温度和pH下进行的。 未接种的Xasks和未加原油的Xasks用作对照。通过测量细菌细胞数量（活菌计数），蛋白质浓度（Lowry等，1951），干生物量（Makkar和Cameotra，1998）以及重量分析残留在培养物中的原油，来评估利用石油烃的细菌生长情况。 接种120小时后加入培养基（Okoh et al。，2001）。

2.6:土壤中石油碳氢化合物的生物降解

通过在室内实验室条件下在土壤中进行120 d的生物降解实验，研究了细菌菌株修复石油原油污染的土壤样品的能力。 将十公斤受石油和原油污染的土壤样品（如下所述检测TPH污染水平）放在30厘米times;45厘米times;10厘米（长times;宽times;高）大小的矩形托盘中。 在开始生物降解实验之前，确定土壤的持水能力，并用从各个细菌菌株获得的生物表面活性剂水溶液（1.0 mg / ml）以每千克10 ml生物表面活性剂溶液的剂量处理土壤样品。 土壤，然后放置3天（温度raquo;37°C和80–89％湿度）。 然后在土壤中播种1升含1pound;107 cfu枯草芽孢杆菌DM-04菌株或铜绿假单胞菌M和NM菌株（按1的比例混合）的矿物盐培养基（Das和Mukherjee，2005）。每个实验重复三次。将土壤彻底磨碎，并每隔2周添加M9培养基，以保持土壤中的水分含量。 每隔30天（根据土壤的持水能力决定）将一升葡萄糖溶液（100 mg / l）补充到每个托盘（十公斤土壤）中，并持续至90天。为了确定生物降解的程度，在120天后分析了土壤相TPH的浓度。平行运行一个对照，其中用未接种的培养基处理土壤。

在试验开始时和试验结束后，土壤的总微生物数（活细胞数）使用无菌营养琼脂（Difco）生长培养基通过标准稀释平板技术进行测定。 如前所述（Das和Mukherjee，2005; Mukherjee和Das，2005），通过比较菌落形态和PCR-RFLP确定枯草芽孢杆菌DM-04，铜绿假单胞菌M和NM菌株在富含石油烃的土壤中的存活率。

2.7:土壤样品中原油和土壤水分含量的化学分析

通过依次用100 ml的己烷，二氯甲烷和氯仿萃取，从10 g的土壤中萃取了总石油烃（TPH）（Mishra et al。，2001）。 合并所有三种提取物，并在通风橱中在温和的氮气流下通过蒸发溶剂在室温下干燥。 蒸发溶剂后，残留的TPH量用重量法测定（Mishra等，2001）。 将TPH进一步分为硅胶，色谱法和重量分析法（Walker等，1975），将其分为芳族，脂族，沥青质和NSO（含氮，硫和氧的化合物）。 将TPH提取物溶解在正戊烷中，分离为可溶和不可溶部分（沥青质）。 将可溶级分加载到硅胶G（60–120目）柱（2 cmtimes;30 cm）的顶部，并用不同极性的溶剂洗脱。 烷烃馏分分别用100毫升己烷洗脱，然后用100毫升甲苯洗脱芳烃馏分。NSO馏分用100 ml甲醇和氯仿洗脱（Mishra等，2001）。

为了测定水分含量，将100 g受石油污染的土壤样品在60°C的烘箱中干燥过夜，然后保存在干燥器中。然后将样品在研钵中压碎，用36目筛子过筛，重新干燥并称重。 重量损失计算为土壤的水分含量。

2.8:气相色谱法分析烷烃馏分

使用FID检测器（Varian Saturn 3800）通过气相色谱法（GC）分析烷烃馏分。该色谱柱为CPSil 8低渗漏（30mpound;0.25mmpound;0.25 m）色谱柱和CP-Sil 5 CB低渗漏/ MS（30mpound;0.25mmpound;0.25m）色谱柱，以氦气为载气。 柱温为80–240°C，持续30分钟，以5°Cminplusmn;1的增量递增，并在240°C下保持30分钟，进样器温度为240°C，传输线温度为300°C。烷烃馏分中存在的各个组分是通过使保留时间与真实标准品匹配来确定的。

2.9:统计分析

统计分析是通过“ t”检验进行的。

  1. 结果

3.1:原油-石油烃中微生物的生长特征和生物表面活性剂的产生

用原油中的碳氢化合物作为唯一的碳和能量来源，从120 h后细菌干生物量，蛋白质含量和细胞密度的增加中可以看出 孵育时间（表1）。枯草芽孢杆菌DM-04，铜绿假单胞菌M和NM菌株分别产生0.65、0.80和0.70 g / l生物表面活性剂（表1）。 在所有情况下，生物量均随孵育时间的增加而增加，在5天内达到最大密度，范围从6.6*105细胞/ ml到8.0*105细胞/ ml。TPH降解模式显示，枯草芽孢杆菌降低了TPS含量1.9plusmn;0.2mg（平均plusmn;SD，n= 3），而铜绿假单胞菌M和NM菌株分别降低了2.7plusmn;0.3 mg（平均plusmn;SD，n=3）和2.3plusmn;0.1mg（平均plusmn;SD，n=3）。 考虑到碳约占细胞干重的50％（Vila等，2001），并且考虑到在没有原油的情况下细菌的生长（碳源）可以忽略不计（数据未显示），因此表明存在同化作用 枯草芽孢杆菌中约有24％，26％和22％的TPH作为细胞碳。

铜绿菌M和NM菌株。 在细菌生长120小时后的所有情况下，均未发现培养基的pH值明显下降。

3.2:PAH对生物表面活性剂的增溶作用

通常，来自所有三个菌株的粗生物表面活性剂以剂量依赖性方式增强了PAH的表观溶解度（表2）。 但是，与所有生物表面活性剂的菲或蒽增溶效果相比，三种表面活性剂对所有三种细菌菌株中的增溶作用（表观溶解度比对照高raquo;5倍）显着更高（比对照高2-3倍）。 此外，与由铜绿假单胞菌M和枯草芽孢杆菌DM-04菌株生产的粗生物表面活性剂相比，由铜绿假单胞菌NM菌株生产的粗生物表面活性剂表现出更高的pyr增溶作用（p ＜0.05）。 另一方面，与来自假单胞菌菌株的粗生物表面活性剂所显示的相同性能相比，来自枯草芽孢杆菌DM-04菌株的粗生物表面活性剂在500mu;g/ ml的剂量下显示出显着更高的蒽增溶作用。

3.3:生物修复前土壤TPH含量和活细胞计数分析

选择用于生物修复实验的土壤样品为壤土和深棕色。 确定土壤的含水量百分比为18plusmn;2（n=3）。在进行生物降解实验之前，土壤的pH值为6.8-7.0（时间为零），并且在实验结束时没有明显变化。 在实验结束时，土壤的持水量从55％增加到68％。 在土壤中TPH污染水平为84.0 g kg·1土壤，烷烃（55.0％）代表了溶剂萃取TPH的最大成分，其次是芳香族组分（20.0％），沥青质组分（16.0％），然后是 NSO（7％）分数（表3）。 确定土壤的土著细菌种群（活细胞计数）为1*104 cfu / g土壤。

3.4:TPH和土壤中各种原油的生物降解

铜绿假单胞菌M和NM财团以及枯草芽孢杆菌菌株对TPH污染的微观世界的生物强化显示TPH水平从84降低到21和39 g / kg的土壤； 相比之下，对照土壤中的TPH水平降低至80 g / kg（表3）。 此外，与枯草芽孢杆菌DM-04和假单胞菌菌群对相同馏分的生物降解相比，本地土壤微生物（对照土壤）对烷烃，芳烃，NSO和沥青质馏分的降解作用微不足道（表3）。平板计数表明外源添加的细菌在石油-油污染的土壤中表达生长，其细胞密度范围从1*1011 cfu / g土壤（枯草芽孢杆菌DM-04）到2*1011 cfu / g土壤（P. aeuruginosa M） 和NM）。相反，在对照土壤中，生物量从1*104cfu / g土壤增加到1*106 cfu / g土壤。

与芳香族或NSO馏分相比，本研究中的所有微生物均表现出更高的正构烷烃馏分生物降解能力。 如表3所示，与枯草芽孢杆菌DM-04菌株相比，假单胞菌财团显示出对生物降解TPH以及原油石油烃的各种其他馏分的显着更高的效

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