昆虫病原真菌白僵菌中非核糖体多肽合成酶在应激反应和宿主导向中的作用外文翻译资料

 2022-08-15 03:08

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昆虫病原真菌白僵菌中非核糖体多肽合成酶在应激反应和宿主导向中的作用

摘 要

球孢白僵菌感染多种有害生物，并会产生杀虫物质，例如非核糖体肽（NRPSs）、白僵菌素和类白僵菌素。然而，大多数NRP及其在球孢白僵菌中的生物学作用仍未被发现。为了确定可能导致发病的NRPSs，将白僵菌 ARSEF 2860的21种预测非核糖体多肽合成酶（NRPS）或类似NRPSs蛋白主要分为三个功能组：基本代谢（7），致病性（12）和功能未知（2）。根据小菜蛾（Plutella xylostella）在体内生长过程中的转录水平，II组一半的NRPS可能与感染有关。鉴于由这些NRPS生物合成的代谢物仍有待确定，我们的结果强调了特定NRPSs在真菌发病机理中的重要性，并将为将来的基因组挖掘项目提供指导，以发现真菌基因组中功能上必需且结构多样的NRPs。

关键词： 非核糖体肽合成酶；次生代谢产物；昆虫病原体

引言

真菌以产生多种次级代谢产物(SMs)而闻名。虽然SMs通常不是生命或繁殖所必需的，但它具有多种生物学活性，如抗生素(如青霉素)、降低胆固醇(如洛伐他汀)和致病介质(如白僵菌素和卵孢菌素)。真菌主要产生非核糖体多肽(NRPs)和聚酮化合物(PKs)，而不是植物[1]的萜烯和生物碱。真菌基因组通常含有许多个编码聚酮合成酶(PKSs)、非核糖体肽合成酶(NRPSs)和杂合PKS-NRPS的核心基因。这些核心酶包含多个结构域，通常负责合成生物合成途径中的第一个中间体。此外，SM生物合成通常需要几种酶才能得到最终产物。在基因簇心酶和修饰酶的编码基因通常是被共调控的，且位于基因组的同一位点。

高度保守的结构域能够快速识别鉴定在给定基因组中NRPS和PKS基因。基因簇的共调控提高了通过计算机提取生物合成途径的信心。近年来，可用真菌基因组的增加和基因组技术的快速发展已成功地将许多先前已知或新化合物与其遗传基础相关联，例如在曲霉属的深入研究中。然而，越来越明显的是，在实验室发酵条件下观察到的代谢谱不能反映大量预测出的微生物的生物合成基因。烟曲霉（Aspergillus fumigatus）是最著名的真菌之一，已经鉴定出14种NRPS中的8种，而其他经过深入研究的真菌（如绿僵菌，白僵菌，稻瘟病菌等）也只有2-4个被鉴定的NRP产物。SM基因位点在没有特定（大多数情况下未知）触发因素的情况下保持沉默，这是一个重要的障碍。这些“沉默”基因可能编码重要的毒力因子，毒素或抗生素的生物合成，这些抗毒因子，毒素或抗生素在抵抗特定压力或宿主时比一般表达的效率更高，因此，研究这些沉默基因的功能对于这一尚未开发的潜在生物活性化合物库的应用是非常重要的，同时了解次生代谢在真菌生存中的成功前景。病原真菌是SM合成的知名载体。他们使用这些SM来协助其致病方式。例如，作为宿主细胞的细胞毒素，宿主免疫系统的抑制剂，保护食物来源不受其他竞争者侵害的抗生素，或面对非生物胁迫的介质。虫草的种类大多数是昆虫病原真菌，可寄生昆虫的幼虫或蛹。球孢白僵菌（球孢白僵菌：冬虫夏草，Hypocreales）是一种宿主范围广的兼性昆虫病原体，被认为是昆虫病原真菌研究的模式生物，并已发展成为针对不同害虫的生物防治剂。球芽孢杆菌基因组拥有21个NRPS（包括NRPS类似44蛋白），提供了一个相对丰富的库来彻底研究特定NRP在真菌生命周期中的作用。由此，主要推断出每种已鉴定出的NRPS或PKS-NRPS的功能或产物，以筛选在常规实验室条件下或在感染期间可能与致病性模式相关的NRPS。因此，在这项研究中，鉴定和分析了当前球芽孢杆菌ARSEF 2860 [11]的基因组序列中所的有NRPS和PKS-NRPS，作为概述其特定NRPSs在昆虫发病机理中意义的第一步。

材料和方法

白僵菌菌株、化学物质和培养条件

在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA, Becton, Dickinson and Company, USA)上保存白僵菌 ARSEF 2860。从生长在PDA平板上的白僵菌菌株中收集空气分生孢子到Triton X-100(0.05%)，并在28℃下培养时间14天。在PDA平板上连续稀释分生孢子，测定分生孢子的浓度。化学品(购自德国Sigma-Aldrich)是可用的最高纯度。

推定基因簇的系统发育树构建与鉴定

基于NRPS的腺苷酸化和缩合结构域的氨基酸序列的比对，构建了NRPS之间的系统发育关系。利用PFAM（http://pfam.sanger.ac.uk/）的AMP结合（PF00501）和缩合结构域（PF00668）模型，鉴定了球孢杆菌基因组中含有腺苷酸和缩合结构域的蛋白质。将与来自NRPS的A和C结构域相对应的片段与MUSCLE（版本3.6）比对。系统进化关系是通过MEGA（5.2版）使用最大似然和最大简约方法构建的。系统发育树内分支的统计支持是通过对1,000个伪重复进行的自举分析得出的。从文献中选择了具有已知功能或已研究的比较过的NRPS。使用在线服务antiSMASH 2.0.2 [19]和NCBI BLASTp对潜在基因簇的鉴定和保守基因的合成进行鉴定。第一个程序允许比较球孢杆菌重叠群和已知保存的真菌和细菌基因组数据库进行比较。

基因表达分析

通过PCR和定量RT-PCR分析了PDA培养基上和小菜蛾感染期间NRPS的基因表达。按照制造商手册的指示，使用Trizol提取法（美国Invitrogen，美国）提取总DNA和总RNA，然后使用快速定量RT试剂盒（含gDNase）（Tiangen，中国）对cDNA进行反转录。使用简单 Taq DNA聚合酶（Transgene）进行PCR，用30个扩增循环周期，94°C 持续30秒，65°C持续 30秒和72°C持续 60秒。引物序列列于表S3中，每个序列（最终浓度）在0.4 micro;mol / l处使用。以DNase处理的未反转录的总RNA和无RNase的DI-HO作为阴性对照模板。在PCR期间，以基因组DNA用作阳性对照的模板。所有引物均可以单条带扩增基因组DNA。

结果

白僵菌基因组中所包含的NRPSs

与其他昆虫或植物寄生性真菌相比，白僵菌基因组中的NRPS基因数量适中。球孢杆菌基因组编码21种NRPS-like和3种PKS-NRPS杂合蛋白（图2，表S1）。预测的蛋白质由腺苷酸化（A），缩合（C），巯基化（T）和其他修饰结构域。A结构域的数量从1到4个不等；在产poptaibol抗菌肽的木霉菌中没有发现很长的NRPS。9个NRPS以典型的末端C结构域结尾（图S1C），而2个和4个NRPSs末端分别具有末端还原酶(R)结构域和巯基还原酶(TD)结构域，这些结构域可以催化多肽的释放和环化。蛋白BBA_06661，尽管在NCBI数据库中标注为NRPS，但附近没有A结构或功能性酶，因此不在此处列出。

图2.球孢白僵菌中非核糖体蛋白合成酶（NRPSs）的域结构和系统发育关系。通过最大似然分析推定的腺苷酸化（A）域的氨基酸序列，可以推断出球孢白僵菌NRPS的系统发育。完整的树包含在支持信息中（图S1）。根据先前的研究[8，18]，由异链球菌和其他已知的NRPS分组的主要进化枝在树的右侧用括号标记。分支上方的数字表示基于1,000个伪复制的每个分支点的引导程序支持百分比（大于60时）。来自芽孢杆菌的酰基辅酶A连接酶用作外基。名称包含物种名称，NCBI索引号和该NRPS中A结构域在总数中的顺序。域的缩写如下：A =腺苷酸化； C ＝冷凝； T =硫醇化：NAD =短链脱氢酶/还原酶，TD =硫酯还原酶：KS =酮acv snnase：AT =酰基转移酶：E =差向异构化：DH =脱氢酶：KR =酮还原酶：ER-烯醇还原酶：MT =酶解。

系统发育树分析可以帮助预测编码的NRPSs在真菌生命周期中的可能功能，尤其是当核心酶和基因簇都保守时。除此之外，解决它们的同源关系可以揭示这些高度可变的酶的进化轨迹。在这项研究中，利用文献中描述的腺苷酰化结构的氨基酸序列构建了NRPS的系统发育树。最终的进化树具有与先前报告（图S1和2）类似的拓扑结构，并且基于Bushley等人的分类，白僵菌 NRPS分布在两个主要类群：单/双模块细菌起源的NRPS和多模真菌起源NRPS。利用系统基因组学背景，可以将白僵菌 NRPS分为三个功能组，如以下文所述。

C结构域的系统发育与腺苷酰化结构相似，但更加模糊（图S1C）。末端C结构域包含一个特异的和排他性的组。那些保守的NRPS（含铁细胞分支ChNPS6和ChNPS2，PKS-NRPS和SidE）仍形成良好支持的C结构域分枝。

为了进一步表征白僵菌特定NRP的功能，在体外生长条件下，于PDA培养基上体外培养白僵菌6天和9天，并在体内感染小菜蛾（Plutella xylostella（Linnaeus））6天后，测量转录水平。先前的研究表明，在不同的处理方式和不同的感染时期，球孢杆菌NRPS基因会动态表达。以白僵菌素和类白僵菌的NRPS为例，尽

图3.在三个条件下使用定量反转录实时荧光定量PCR（qRT-PCR），球孢白僵菌非核糖体蛋白合成酶（NRPS）基因的表达水平：在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上6天或9天以及感染后6天小菜蛾。18S rDNA被用作内标。数据值一式三份取平均值，并表示目标基因和18S rDNA的表达水平之间的差异。也就是说，负数越少表示表达越高。

管这两个基因的表达在不同时期达到峰值，但这两个基因在整个感染过程中，无论采用何种处理方法(例如分生孢子悬浮液或者或芽生孢子注射处理昆虫)，但都在整个感染过程中表达,。因此，小菜蛾感染期间，NRPS基因的转录水平主要可以筛选出具有普遍活性或特定于特定宿主类型的NRPS，但不能时间过程的变化。利用反转录的cDNA为模板，通过PCR检测每个NRPS基因的表达情况（图S4），利用反转录定量PCR（qRT-PCR）对差异转录水平进行定量检测（图3和S4）。 当一个基因的转录水平显著高于阴性对照(列如未反转录的RNA提取物)，并且反转转录的cDNA的PCR带可以观察到，它可被描述为“表达”。

保守的NRPS及其功能预测

与多模块NRPS相比，单/双模块NRPS相对保守，其结构域功能保守。根据它们的系统发育关系推导出的进化背景，可以推测这些保守的NRPS的功能。这些NRPS通常被观察到参与有性发育、生殖、铁代谢、圆锥体发育和细胞毒性，并在动植物病理中广泛传播，腐植物中也是如此。另外，在本研究和文献中，保守的NRPS基因的转录在不同条件和/或生长期之间趋于稳定。

第一组：基本代谢

第一组的NRPS占了白僵菌NRPS的很大一部分，在腐生和致病的方式中都是相对不可缺少的。因此，它们在所有测试条件下均以通常高于其他NRPS基因的水平转录（图3和S4），因此，第一组NRPSs被归为“基本代谢”。4个白僵菌 NRPSs组在SidC/fer3亚家族中合成铁菌素和铁色素胞内铁载体;但只有BBA_05020，具有典型的结构域，如已被充分证明的担子菌纲玉蜀黍黑粉菌（Ustilago maydis）Sid2 ，子囊菌粟酒裂殖酵母Sib1 [32]和烟曲霉SidC [33]。在这项研究中，BBA_05020的转录水平也最高，以前的转录组学测量表明，其产物是主要的铁螯合剂（图3）。类似于NRPS的其他三个SidC（BBA_00963，BBA_05179和BBA_08246）仅包含一个A结构域和一个C结构域，类似于SidC / fer3的第一个模块（图2）。有趣的是，BBA_00963和BBA_05179基因附近分别有一个PKS（BBA_00967）或PKS-NRPS杂合（BBA_05176）基因，以及一个单独的烯酰还原酶（ER）。在虫草CM01和白曲霉IFO 4308中也可以找到类似的簇组织（图4A）。白僵菌NRPS还包括细胞外铁载体合成酶ChNPS6 / SidD（BBA_06997）的同源物，这是一种已被证实的对各种病原体的毒力决定因子。与类似SidC NRPS不同，BBA_06997是一种真菌特异性铁载体合成酶。该组中的另外两个基因，BBA_04028和BBA_08280，分别与ChNPS10（一种参与形态发育的NRPS样蛋白）[25]和AAR（氨基酯酸还原酶）同源，在真菌赖氨酸生物合成途径中，负责还原alpha;-氨基己二酸，并广泛存在于真菌届。这两个NRPS的结构域结构和基因簇都是保守的。补充结果中对此类NRPS有更多描述。

图4所示。白念珠菌保守非核糖体蛋白合成酶(NRPS)基因簇的合成与重排。将白僵菌中基因簇的组织与之前在antiSMASH数据库中描述的进行了比较。

第二组：致病性

大部分可能参与致病性的NRPSs在基因和基因簇水平上并不保守，除了侧结构域的NRPS, BBA_07589。BBA_07589的A、C结构域均与烟曲霉菌的NRPS侧结构域同源(gt;99 bootstrap值)。BBA_07589与SidE具有相同的域结构，以C端域为释放机制，附近有C6转录因子和MFS转运蛋白。SidE在系统发育上与Sid

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