棉花幼苗中的镉胁迫：甘氨酸甜菜碱减缓了生理，光合作用和氧化损伤外文翻译资料

 2022-02-13 08:02

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棉花幼苗中的镉胁迫：甘氨酸甜菜碱减缓了生理，光合作用和氧化损伤

摘要

农业土壤中镉含量主要通过人为活动不断增加。镉是土壤中最具植物毒性的金属之一。本研究探讨了外源性应用甘氨酸甜菜碱（GB）在水培系统中减轻棉花植株镉毒性的可能作用。分别用GB（1mM）和无GB叶面喷施法测定3种浓度的镉（0、1.0和5.0mu;M）。镉中毒使植株高度、根长、单株叶数、叶、茎、根鲜、干重显著下降，不同部位镉浓度显著升高。镉的毒性也降低了叶片的光合色素和气体交换特性。

超氧化物歧化酶（SOD）、愈创木酚过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸（APX）活性在低镉胁迫（1.0mu;M）下升高，而在高镉胁迫（5.0mu;M）下降低。镉的毒性通过丙二醛（MDA）、过氧化氢（H2O2）和电解质在叶和根中的泄漏增加，从而增加活性氧（ROS）的浓度。应用GB降低了不同植物部位的镉浓度，减轻了镉对植物生长和生物量的抑制作用，使光合色素、蛋白质含量和抗氧化酶显著增加。甘氨酸甜菜碱的应用减轻了氧化损伤，这可以通过减少电解质泄漏、H2O2和MDA含量来证明。这些结果表明，通过降低镉浓度和调节不同部位镉诱导的氧化应激，可能通过提高抗氧化酶系统的性能来减轻棉花镉的毒性。

关键词：抗氧化酶；镉；棉花；甘氨酸甜菜碱；氧化损伤

  1. 介绍

人类活动（包括有毒气体、杀虫剂和重金属）释放的环境污染物已威胁到全球生物群的存在。在这些污染物中，农业土壤的重金属污染是一种严重的环境威胁，影响植物的许多生理和代谢过程，最终降低植物生长、光合作用和生物化学活性。在重金属中，镉（Cd）是最具植物毒性的元素之一，在动植物中没有已知的生物功能。镉胁迫还降低了植物对必需元素的吸收和分布。虽然镉不是氧化还原活性金属，但它会导致氧化应激。

植物通过形成活性氧（ROS），包括超氧阴离子（O）和过氧化氢（H2O2）等。在镉胁迫下，活性氧的过度生产可能导致植物的生理紊乱，从而导致生长和生物量减少。为了避免氧化应激的有害影响，植物进化出了完善的活性氧清除酶装置，如超氧化物歧化酶（SOD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、愈创木酚过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）。研究表明，在较高的镉胁迫下，抗氧化酶的活性增加到一定水平后，然后降低。这表明，在严重的镉胁迫条件下，植物的抗氧化酶能力可能不足以防止金属的毒性作用。

在临界条件下，植物对重金属应力（包括镉应力）采取了不同的保护措施。压力条件下的一个这样的适应性机制是相容溶质的积累，包括甘氨酸甜菜碱（GB）和脯氨酸。甘氨酸甜菜碱是高等植物在压力环境下产生的最丰富的季铵盐化合物之一。甘氨酸甜菜碱参与保护植物免受干旱、盐度和重金属胁迫等多种胁迫。有研究表明，在压力条件下，GB还可以保护许多植物物种免受氧化应激。然而，GB的自然生产不足以在严重的胁迫条件下保护植物。在这种情况下，外源应用gb可能是克服植物非生物胁迫的有效策略。据报道，外源性gb通过提高抗氧化酶活性增强水稻幼苗的耐盐性，通过改善气体交换特性增强小麦的耐旱性。然而，其反应因植物种类和基因型而异。外源性gb还降低了许多植物物种的重金属毒性。然而，在GB介导的减轻植物金属毒性的机制背后，几乎没有信息。

因此，在上述讨论的基础上，本研究旨在通过降低镉摄取量或通过影响镉胁迫下的生长、光合作用和抗氧化酶活性来测试外源性GB应用是否能够改善巴基斯坦和全球重要经济作物棉花的耐镉性。为此，在无和1.0 mM gb的情况下，用三种浓度的cd（0、1.0和5.0mu;m）进行了水培试验。收获后，测定了不同植株的生物量、茎、根长、单株叶片数、光合色素和气体交换特性、蛋白质含量和不同部位镉浓度等形态生理参数。测定了不同植物部位的氧化应激、丙二醛（MDA）、过氧化氢（H2O2）、电解质渗漏（EL）及主要抗氧化酶SOD、POD、APX和CAT的活性，评价了GB对抗氧化酶活性降低氧化应激的作用。

2. 材料和方法

2.1生长条件

从阿尤布农业研究所（Ayub Agricultural Research Institute，AARI）采集棉花基因型MNH 886的健康种子，浸泡在浓硫酸溶液中约15分钟，以去除种子表面的短纤维。然后用蒸馏水彻底冲洗种子，并在2层灭菌石英砂盘中播种，在光周期为16 h光/8 h暗的生长室中，光强度为400plusmn;25mu;molms。将光/暗温度设置为30°C/25°C，相对湿度设置为85%。2周后，在根-枝连接处用泡沫包裹均匀的幼苗，并将其移植到具有40L容量的铁桶中的均匀间隔的孔的热塑性片材中，内衬有含有改性的霍格兰溶液的聚乙烯片材。通过在营养液中的气泵通过制造气泡进行连续曝气。每周更换一次解决方案。采用完全随机设计（CRD）。移植后两周，Cd水平（对照组0mu;m、1.0mu;m和5.0mu;m）以CDCL2的形式分布，两个GB水平（对照组和1 mM）复制5次。通过添加1 M H2SO4或NaOH溶液，使溶液pH保持在6.0plusmn;0.1。21

2.2植物生长和生物量的测定

植物在镉胁迫下生长6周后收获。在测定了茎和根的长度后，将植物分为叶、茎和根，用蒸馏水彻底清洗，擦拭植物材料，并测定了这些植物部分的鲜重。

在此之后，样品在70°C下烘干约72 h，然后称重。

2.3气体交换参数和叶绿素含量

用红外气体分析仪（IRGA）（分析开发公司，英国霍德斯登）测定了Cd和GB处理6周后每株植物最年轻叶片的光合速率（A）、气孔导度（GS）、蒸腾速率（E）、水分利用效率（A/E）。这些测量是在上午10:00至11:30之间进行的，生长条件如上所述。

用分光光度法测定叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素。处理6周后，称重最顶部完全膨胀的新鲜叶片，并将其浸入85%（v/v）丙酮中过夜，以提取叶绿素色素。取上清液，以4000转/分的速度离心10分钟，并用85%丙酮稀释至合适的浓度，以便分光光度测定。在452.5、644和663nm的吸光度下，计算了85%液体丙酮空白处的消光率。用分光光度计测定chl a、b、总叶绿素和类胡萝卜素。利用调整后的消光系数和方程计算叶绿素和类胡萝卜素含量。

2.4过氧化氢、丙二醛和电解质渗漏的测定

根据Jana和Choudhuri（1981）的描述，采用比色法测定H2O2含量。通过用3ml磷酸盐缓冲液（50 mm，pH6.5）使50 mg叶或根组织均匀化来提取H2O2。为了测定H2O2含量，在20%（v/v）硫酸中，将3 ml提取液与1 ml 0.1%硫酸钛混合，在6000times;g的条件下离心15分钟，用分光光度计在410 nm处测定上清液的黄色强度。用0.28mu;molcm的吸光度系数计算H2O2含量。

采用Heath and Packer（1968）方法，通过硫代巴比妥酸（TBA）反应测定叶片组织中的丙二醛含量（脂质过氧化产物丙二醛），并根据Zhang和Kirham（1994）的描述进行少量修改，测定叶片组织中的脂质过氧化水平。将0.25 g叶片样品在5 ml 0.1%TCA中均匀化。将匀浆在10000times;g下离心5分钟至1 ml上清液，添加4 ml 20%TCA（含0.5%TBA）。将混合物在95°C下加热30分钟，然后在冰浴中快速冷却。在10000times;g离心10分钟后，读取532 nm处上清液的吸光度，减去600 nm处的非特异性吸收值。采用155 mmcm的吸光度系数计算丙二醛含量。

采用Dionisiosese和Tobita（1999）的方法估算电解质泄漏。处理6周后，将叶片样品切成5 mm长的小部分，放入含有8 ml去离子和蒸馏水的试管中。将管置于32℃水浴中2小时。评估了介质（EC1）的初始导电率。对于第二导电性（EC2），将样品置于121°C的高压釜中20分钟，以排出所有电解质。样品在25°C下冷却。使用以下公式计算总电解质泄漏：

EL frac14; eth;EC1=EC2THORN; 100

2.5抗氧化酶和可溶性蛋白含量的测定

采用分光光度法测定了根、叶中SOD、POD、CAT、APX等抗氧化酶的含量。经过6周的处理后，新鲜的叶和根样品（0.5g）在研钵和研杵的帮助下进行研磨，并在冷冻条件下在0.05m磷酸盐缓冲液（pH7.8）中均匀化。均化后的混合物经四层细布过滤，在12000g的条件下在4°C的温度下离心10分钟。根据Bradford（1976）的规定，以考马斯亮蓝G-250为染料和白蛋白为标准，分析可溶性蛋白质含量。

在抑制硝基蓝四氮唑（NBT）光化学还原作用后，用张法测定了超氧化物歧化酶（SOD，酶代码EC1.15.1.1）的活性。反应混合物由50 mM磷酸钾缓冲液（pH7.8）、13 mM蛋氨酸、75mu;mu;NBT、2mu;mu;核黄素、0.1 mM EDTA和100mu;L酶提取物组成，体积为3-ml。测定了一单位SOD活性，即在560 nm下抑制NBT还原所需酶的量。

周和梁（1999）对过氧化物酶（POD，EC1.11.1.7）活性进行了测定，并做了一些修改。反应物混合物含有50 mM磷酸钾缓冲液（pH7.0）、1%愈创木酚、0.4%过氧化氢和100mu;L酶提取物。由于愈创木酚在470纳米的吸光度测量变化。

过氧化氢酶（CAT，酶代码EC1.11.1.6）活性通过AEBI（1984）法测定。分析混合物（3.0 ml）由100mu;l酶提取物、100mu;l H2O2（300 mm）和2.8 ml 50 mm磷酸盐缓冲液和2 mm EDTA（pH7.0）组成。通过监测由于H2O2消失（ε=39.4 mM/cm）导致的240 nm处吸光度下降来测定CAT活性。11

抗坏血酸过氧化物酶（apx，酶代码EC1.11.1.11）活性根据Nakano和Asada（1981）的方法进行测定。反应混合物由100mu;l酶提取物、100mu;l抗坏血酸盐（7.5 mm）、100mu;l H2O2（300 mm）和2.7 ml 25 mm磷酸钾缓冲液（2 mm EDTA）（pH7.0）组成。抗坏血酸的氧化作用是通过290nm（ε=2.8 mM/cm）处吸光度的变化来测定的。11

2.6GB含量测定

根据格里夫和格拉顿（1983年）估计GB含量。用温蒸馏水（70℃）从植物材料中提取叶甘氨酸甜菜碱。将提取物（0.25 ml）与0.25 ml 2 N HCl和0.2 ml三碘化钾溶液混合。在冰浴中摇动内容物并冷却90分钟。然后将2.0 ml冰冷却蒸馏水和20 ml 1–2二氯甲烷（在-10°C下冷却）添加到混合物中。这两层是在混合物中形成的。去除上层水层，在365 nm处测量有机层的光密度。以鲜重为基础计算甘氨酸甜菜碱的浓度。

2.7镉浓度的测定

每个样品（0.5g）干燥灰化，用盐酸萃取，3600转/分离心15分钟。通过火焰原子吸收光谱法测定根、茎和叶中的镉浓度。

2.8统计分析

本实验报告的所有数值均为5次重复的平均值。方差分析（ANOVA）是通过使用统计学软件包，SPSS版本16.0（SPSS，芝加哥，伊利诺伊州），然后通过Tukey检验来确定治疗方法之间的显著差异。

3. 结果

3.1甜菜碱和镉对植物生长和生物量的影响

与植物生长参数、株高、根长、单株叶数、生物量、叶、茎、根鲜、干重有关的结果见表1。与对照相比，生长介质中的镉浓度导致植物高度显著降低。与对照相比，1.0mu;m和5.0mu;m的镉浓度下，株高的下降分别为28.19%和61.17%。GB的应用使镉胁迫棉花幼苗的株高显著提高。与无GB处理的植株相比，GB处理的植株高度在0、1.0和5.0mu;m cd下分别增加了12.74%、23.91%和30.52%。与对照组相比，镉处理组根长和单株叶片数明显减少。在高镉（5.0mu;m）处理下，根系长度和每株叶片数的最大减少量记录在案，与对照组相比，根系长度和每株叶片数分别减少了63.41%和72.12%。在镉胁迫下添加绿豆，与未施用绿豆的处理相比，显著增加了单株的根长和叶片数，尤其是在生长介质中镉含量较高的情况下，效果更为显著。

在镉胁迫的棉花植株中，叶片、茎和根的鲜重和干重显著降低（表1）。与对照相比，镉胁迫使叶片、茎和根的鲜重显著下降。与仅用镉处理的植物相比，在生长介质中添加GB和镉导致不同植物部分的新鲜生物量显著增加。与对照组相比，在镉胁迫下，这些植物部分的干重也以剂量依赖的方式降低。与对照组相比，1.0mu;m镉胁迫使叶片、茎和根的干重分别比对照组下降41.56%、46.54%和50%，而5.0mu;m镉胁迫使叶片、茎和根的干重分别比对照组下降65.4%、70%和70.51%。与纯镉处理相比，在两种镉水平下，应用GB显著增加了不同植物部位的干重。与5.0mu;m cd胁迫相比，5.0mu;m cd gb处理的植株叶、茎、根干重分别增加30%、21.21%和28.13%。

3.2甘氨酸甜菜碱和镉对叶绿素和气体交换的影响

结果与光合色素、叶绿素a（chl a）、叶绿素b（chl b）、总叶绿素和类胡萝卜素以及气体有关。

不同浓度的镉（0、1、5mu;m）和甜菜碱（GB）（0、1mm）对棉花植株生长参数和生物量的影响。值表示5次复制的平均值plusmn;SE。不同的字母表示在p b 0.05时数值有显著差异。

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