英语原文共 6 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料
一种使用高效液相色谱/电喷雾电离质谱法评估基因组DNA甲基化的方法
Simonetta Friso,*,dagger; Sang-Woon Choi,dagger; Gregory G. Dolnikowski,Dagger; and Jacob Selhubdagger;
维生素代谢实验室和质谱实验室，Jean Mayer美国农业部塔夫茨大学人口老龄化研究，马萨诸塞州波士顿02111
真核DNA在一些胞嘧啶残基处被甲基化,这种表观遗传特征执行关键功能。我们开发了一种使用液相色谱/电喷雾电离质谱（LC / ESI-MS）定量测定人DNA中5-甲基-2#39;-脱氧胞苷的方法。通过用三种酶连续消化来酶水解DNA。随后通过等度模式下的反相高效液相色谱分离DNA水解产物。四个主要的DNA碱基和5-甲基-2#39;-脱氧胞苷在13分钟内消退并被洗脱。通过组合二极管阵列UV光谱分析和色谱峰的质谱获得2#39;-脱氧胞苷和5-甲基-2#39;-脱氧胞苷的鉴定。同位素[15N3] -2#39;-脱氧胞苷和（甲基-d3，环-6-d1）-5-甲基-2#39;-脱氧胞苷用作内标。m / z 126和130的离子用于检测5-甲基-2#39;-脱氧胞苷及其同位素异构体,m / z 112和115的离子分别用于检测2#39;-脱氧胞苷及其稳定的同位素异构体。基于每微克DNA的5-甲基-2#39;-脱氧胞苷的量计算DNA甲基化状态。方法精度为7.1（日内）和5.7（日常）的百分比相对标准偏差（％RSD）。该方法还可以测量5-甲基-2#39; -脱氧胞苷表示为基因组DNA中总脱氧胞苷残基的百分比，％RSD，方法精确度为1.9（日内）和1.7（日常）。这种用于定量测定基因组DNA甲基化状态的LC / MS方法是快速，敏感，选择性和精确。
许多真核基因组的一个特征是CpG二核苷酸的碳5#39;位置的胞嘧啶甲基化。通常，胞嘧啶的甲基化主要发生在富含CpG的区域，即所谓的“pG岛”，它们主要位于基因启动子区域或基因的初始外显子中。DNA甲基化是基因表达的表观遗传控制和基因组完整性维持的基本机制。因此，基因组DNA甲基化状态的评估对于细胞生长调节，组织特异性分化，1,2,6和癌发生的研究至关重要。
评估基因组DNA甲基化状态的两种最广泛使用的方法是使用甲基化敏感性限制性内切核酸酶消化后的Southern印迹技术和以及利用细菌DNA甲基转移酶的放射性测定法在体外用放射性甲基供体催化胞嘧啶 - 鸟嘌呤双联体位点的从头甲基化。最近，描述了另一种基于甲基化敏感内切核酸酶的方法，随后用放射性标记的[3H] -dCTP16进行单核苷酸延伸。通常，由于甲基敏感内切核酸酶活性的不一致和甲基转移酶活性的不稳定性，这些方法在精确度方面存在很大差异。
色谱法已用于分离嘌呤和嘧啶18以及鉴定修饰的嘌呤脱氧核糖核苷。反相高效液相色谱（HPLC）方法也已应用于全基因组甲基化分析。然而，这些HPLC方法需要微克量的基因组DNA（5-50mu;g）和32P标记的脱氧核糖核苷的合成以及相对长的运行时间。
1976年，一种质谱技术被描述为可在检测和鉴定来自完整的未衍生化DNA的5-甲基化胞嘧啶残基中获得更高的灵敏度。此后，在20世纪80年代，使用N-甲基N（叔丁基）二甲基甲硅烷基三氟乙酰胺的衍生化方法用于检测使用氘标记的5-甲基胞嘧啶通过稳定同位素稀释GC / MS描述5-甲基胞嘧啶用于分析小牛胸腺DNA中的修饰碱基。在用三氟乙酸酐衍生化后也获得了5-甲基胞嘧啶的分离和检测。另一项研究描述了HPLC与GC / MS28结合使用，以实现双（三甲基甲硅烷基）三氟乙酰胺衍生化后鉴定游离DNA碱基更好的特异性。GC / MS在DNA水解产物中的应用受到限制，但是，由于这些化合物的固有极性。
电喷雾电离（ESI）的发展使得液相色谱/质谱（LC / MS）可用于大量极性/离子分子的定量测定和结构表征，例如核酸在生物样品中。最近建议使用LC / MS评估从绿藻中纯化的DNA中的基因组甲基化。然而，这个程序需要相当大量的DNA（25mu;g），单个核苷的32P标记，并使用HPLC和MS的离线组合，其中HPLC用于通过保留时间和紫外（UV）吸光度分离和鉴定脱氧核糖核苷，并且ESI-MS 34用于分别分析作为HPLC级分收集的化合物。
我们在这里描述了一种新的在线LC / MS方法，用于测量1mu;g基因组DNA中的甲基化胞嘧啶残基。该LC / MS方法允许定量测定基因组DNA甲基化状态。该技术依赖于DNA的定量水解和完全去除潜在的残留RNA，并且能够通过ESI-MS分离和鉴定DNA碱基和5-甲基-2#39;-脱氧胞苷。
实验部分
仪器.使用Hewlett Packard / Bruker Esquire-LC离子阱液相色谱仪/质谱仪（Billerica，MA）进行实验。所有HPLC系统设备均来自HP 1100系列，由真空脱气机（型号G1322A）组成，四元泵（型号G1311A），自动进样器（型号G1329A），恒温柱室（型号G1316A）和二极管阵列检测器（DAD）（型号G1315A）, 使用由5-mu;mSuplexpKb 100预柱（2cmtimes;2.1mm）（Supelco，Bellefonte，PA）保护的Suplex pKb 100分析柱（25cmtimes;2.1mm）。HPLC系统由HP ChemStation软件控制。来自Bruker Daltonik（德国不来梅）的质谱仪配备有电喷雾电离（ESI）源。质谱仪系统由Esquire-LC NT软件4.0版控制。这两个软件包都在Microsoft Windows NT 4.0版操作系统下的HP Kayak XA PC上运行。
试剂.流动相由7mM乙酸铵pH 6.7 /甲醇5％（v / v）组成，并使用HPLC级水，甲醇（均来自J.T.Baker，Phillipsburg，NJ）制备，和乙酸铵（Aldrich，Milwaukee，WI）。在使用前，将流动相通过0.2-mu;m尼龙膜过滤器（Alltech，Deerfield，IL）过滤。稳定同位素标记的化合物[15N3] 2#39;-脱氧胞苷和定制的（甲基-3-环-6-d1）-5-甲基-2#39;-脱氧胞苷（均来自Cambridge Isotopes Laboratories，Inc.，Andover，MA）分别用作2#39;-脱氧胞苷和5-甲基-2#39;脱氧胞苷残基的内标.质量控制数据显示[15N3] 2#39;-脱氧胞苷的化学纯度为98％，（甲基-d3，环-6-d1）-5-甲基-2#39;脱氧胞苷为95％ ，同位素富集为98％ 两种化合物。
使用5-甲基-2#39;-脱氧胞苷和2#39;-脱氧胞苷（Sigma，St.Louis，MO）的混合物作为外标，以产生校准曲线，评估该技术对这些化合物的敏感性，并确定检测限制。
CpG基因组通用酶促甲基化人类雄性使用基因组DNA（Intergen Company，Purchase，NY）来评估人体中不同量的5-甲基-2#39;-脱氧胞苷脱氧核糖核酸。
DNA提取和水解.使用经典的酚/氯仿/异戊醇[25：24：1（v / v / v）]方案从人血液的血沉棕黄层中提取基因组DNA。用RNase A和T1（Invitrogen，Carlsbad，CA）处理残留RNA至终浓度10单位/ mL，37℃保持1小时。将DNA用7.5M乙酸铵（1：1/2，v / v）和100％乙醇（1：2，v / v）再沉淀，并溶于TE缓冲液（10mM tris-HCl，1mM EDTA pH 8.0）中。将DNA在0.025-mu;m滤纸（Millipore，Bedford，MA）上透析，并储存在-70℃直至分析。如Crain所述进行DNA水解的过程。简言之，通过在100℃加热3分钟使1mu;gDNA变性，随后在冰泥中冷却。十分之一体积的0.1M乙酸铵（pH5.3）和2单位核酸酶P1（罗氏分子生物化学公司，德国曼海姆，德国）被增加了。然后将混合物在45℃下孵育2小时。随后向溶液中加入1/10体积的1M碳酸氢铵（Sigma，St.Louis，MO）和0.002单位的毒液磷酸二酯酶I（Sigma，St.Louis，MO）。在37℃下继续孵育2小时。然后将稳定同位素[15N3] -2#39;-脱氧胞苷和（甲基-d3，环-6-d1）-5-甲基-2#39;-脱氧胞苷加入样品中，使最终浓度达到1和0.5ng /mu;L，分别在总体积为35mu;L。
图一. DNA消化物的典型LC / MS色谱图。在上图中表示在人PBMC DNA完全酶水解并在254nm处检测后获得的UV色谱图。第一个峰在4.5之后洗脱（0.5分钟对应于胞嘧啶（Cyt），第二个峰在6.5之后洗脱（0.5分钟对应于5-甲基胞嘧啶（mCyt））。在中间面板中表示典型的MS色谱图。前两个MS峰对应Cyt（m / z）112）及其稳定同位素（m / z）115），后两个峰对应mCyt（m / z）126）及其稳定同位素（m / z））130），如下图所示。
LC / ESI / MS程序.在使用之前，检查仪器以满足制造商定义的灵敏度。使用用于HP1100系统的化学工作站软件的DAD诊断程序校准和测试DAD。使用从安捷伦科技（Palo Alto，CA）获得的ESI调谐溶液校准HP1100 MSD。校准质谱仪，以便在整个质量范围内实现质量准确度规格和灵敏度。
将20mu;L部分的水解DNA溶液注射到恒温在21℃的分析柱上。通过等度洗脱获得四种主要DNA碱基的分离以及5-甲基-2#39;-脱氧胞苷的分离。流动相流速为0.3mL / min，运行时间为13min。电喷雾源条件是毛细管，30nA和氮气干燥气体，9.0 L / min，辅助40.0 psi气体，有助于雾化和干燥温度350°C。 质谱仪在2500V的毛细管电压下操作以正离子模式收集光谱。电喷雾针保持在地面上。设定离子阱质量范围以在两个不同的时间窗口中评估来自m / z 110至118的2#39;-脱氧胞苷和来自m / z 125至132的5-甲基-2#39;-脱氧胞苷。2#39;-脱氧胞苷的时间窗为0-5.5分钟，5-甲基-2#39;-脱氧胞苷的时间窗为5.5-13分钟（如图1所示）。 收购通常是16个时间点/分钟。 每个时间点获得60次扫描，并且在存储到数据库中之前进行平均。通过在254和280nm下组合UV检测获得2#39;-脱氧胞苷和5-甲基-2#39;-脱氧胞苷的鉴定，并且MS分析 4.5（0.5和6.5分钟后）分别洗脱的色谱峰。
结果和讨论
使用如所述的反相柱获得四种碱基和5-甲基-2#39;-脱氧胞苷残基的分离。Zambonin等人使用流动相的等度洗脱修改了该方法，所述流动相由7mM乙酸铵pH 6.7 / 5％甲醇组成。 时间是13分钟。
如方案1所示，电喷雾电离条件导致2#39;-脱氧胞苷和5-甲基-2#39;-脱氧胞苷中2#39;-脱氧核糖部分的损失和分子量与添加的一致的碎片离子的产生。 两个DNA碱基的嘧啶环质子（分别为m / z 112和126）。
正如预期的那样，ESI源，质谱仪处于正离子检测模式，为2#39;-脱氧胞苷和5-甲基-2#39;-脱氧胞苷提供了质子化分子和碎片离子。 我们选择监测目标化合物的碎片离子而不是质子化分子，因为它们提供了更多的信号和更好的定量结果。
a在分离DNA碱基后，ESI条件导致戊糖部分与两者的嘧啶环分离2#39;-脱氧胞苷（wt=227.1）和5-甲基-2#39;-脱氧胞苷（wt=241.2）并导致分别产生胞嘧啶（wt=111.10）和为5-甲基胞嘧啶（wt=125.13）。最终碎片离子的分子量与向两个DNA碱基的嘧啶环中添加质子一致（胞嘧啶，m / z = 112; 5-甲基胞嘧啶m / z = 126）。
图1显示了纯化和完全水解的外周血单核细胞（PBMC）DNA样品的典型LC / MS色谱图。 上图显示了在254nm处获得的UV色谱图。中间面板显示一组质谱图。 HPLC峰在4.5（0.5分钟和m / z 112对应于2#39;-脱氧胞苷）后洗脱，HPLC峰在6.5（0.5分钟，和m / z 126对应于5-甲基-2#39;-脱氧胞苷）后洗脱。
UV色谱图用于验证DNA样品的完全消化以及RNA残基的缺失。如Crain等人先前所述，由于一种或多种酶的异常功能导致DNA的不完全消化可能对结果产生不利影响，特别是鉴于DNA中存在极少量的5-甲基-2#39;-脱氧胞苷。RNA的存在会干扰DNA中甲基化胞嘧啶残基的测定，因为tRNA和rRNA都含有5-甲基胞苷.由于在ESI过程中戊糖部分的丧失，5-甲基胞嘧啶仅归因于DNA是不可能的。因此，我们尝试通过使用两种不同的RNA酶并通过再沉淀来清除DNA来尽量减少可能的RNA污染。在RNA污染的情况下，色谱图显示存在在3.5plusmn;0.5分钟洗脱的额外峰。如实验部分所述，ESI源与质谱仪处于正离子检测模式,给予质子化分子以及2#39;脱氧胞苷和5-甲基-2#39;-脱氧胞苷的碎片离子,其分子量与两个DNA碱基的嘧啶环上加入质子一致（图1）。在3.5plusmn;0.5分钟洗脱的分子的分子量与向胞苷残基（m / z 244）中添加质子一致。如上所述，处理所有DNA样品以避免残留RNA的存在，并且没有检测到额外的峰。
如图1所示，m / z 115处的离子对应于同位素标记的[15N3] 2#39;-脱氧胞苷，m / z 130处的离子对应于标记的同位素（甲基-d3，环-6-d1）-5-甲基-2#39;-脱氧胞苷
全文共7961字，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料
资料编号：[452792]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word
以上是毕业论文外文翻译，课题毕业论文、任务书、文献综述、开题报告、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
