水杨酸包裹的磁性纳米粒子一步提取基因组DNA外文翻译资料

 2022-05-02 10:05

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水杨酸包裹的磁性纳米粒子一步提取基因组DNA

摘要

通过改进的一步合成法制备得到水杨酸包裹的磁性纳米颗粒，并将其应用于从哺乳动物细胞中一步提取基因组DNA。合成的磁性纳米颗粒可以通过非特异性结合从介质中分离细胞，并从裂解物中提取基因组DNA。 其提取量和完整性通过琼脂糖凝胶电泳和聚合酶链式反应来确定。整个提取和分离过程可在30分钟内完成。 与基于离心和过滤的传统方法相比，所建立的方法快速，简单，可靠，环保。

关键词：水杨酸; 磁性纳米粒子 基因组DNA; 提取; 简单快速

近年来，由于磁性纳米材料在生物医学和生物学中应用中的极大可能性，使用磁性纳米材料进行生物分子的分离得到了广泛的关注。 磁性纳米颗粒（MNPs）已被用作载体来直接从化学或生物学悬浮液中富集和纯化细胞，细胞器和生物分子（包括核酸，蛋白质和异生素）。磁珠法与其他传统技术相比具有许多优势，特别是在生物分离和提取中。分子生物学，生物化学和化学中使用的传统分离技术依靠的是离心和或过滤。虽然这些确定了各种应用和过程的标准，但离心或过滤均不适用于自动化及快速分离，且往往需要强烈的机械分离力。而磁分离技术快速且具有选择性，不需要复杂的方案，昂贵的设备或过滤仪器。

细胞和核酸的磁分离纯化方法相比于传统方法有很多优点，特别是操作简单，在室温条件下有可能实现环保提取（不需要大量有毒化学物质）。分子生物学方法，如PCR扩增和限制性消化，都需要高分子量的DNA。 与会对DNA施加剪切力的离心和过滤的技术相比，磁分离仅施加磁阻，对生物分子无破坏性和侵入性。

目前，基于DNA的分析是分子生物学中最常见的分析方法，也是生命科学研究的基础。 基于MNPs的分离可以提供质量更高的DNA，用于酶消化，聚合酶链反应，表观遗传标记检测和测序，且该方法操作简单，几乎不含有毒化学物质或依靠力来进行分离（如离心方法）。但是，制备功能化和单分散的MNPs的步骤以及使用商品化磁力分离试剂盒的成本阻碍了这一技术在生物化学或临床筛选的常规应用。

水杨酸（SA）具有羧基和酚官能团 ，通常用作螯合树脂中的改性剂，它具有优异的吸附性能 。 它也被用来包裹MNPs，用来做固相分离及从各种不纯样品中进行重金属离子的浓缩。 然而， 用水杨酸包裹的磁性纳米颗粒（SAMNPs）作为载体进行基因组DNA（gDNA）分离还尚未报道。 在这里，我们报告一种修改过的，简单且可靠的SAMNPs合成技术，并证明我们合成的SAMNPs是可以从复杂的细胞培养基中一步分离得到基因组DNA的。通过琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增来验证我们制备的SAMNPs纯化的基因组DNA的质量和数量。

通过一步湿化学策略制备水分散性SAMNP，这种方法是在Unal等人的先前的制备方法基础上进行修改过的。简单来说，就是将NaOH和SA的混合物溶液加入灭菌的三颈瓶中，在Ar气保护，剧烈搅拌的条件下将pH调至约为11，随后加入含有Fe（III）和Fe（II）盐的混合溶液，其中Fe（III），Fe（II），SA的摩尔比为2:1:4，直到形成黑色悬液。在90℃回流4小时后，可以观察到深棕色悬液。研究发现发现用氢氧化钠代替氢氧化铵可有效控制液体的流动性。此外，用这种方法制备的SAMNPs比以前报道的要小得多。较小的尺寸使SAMNPs具有较高的表面积与体积比，可以最大化与外界相互作用。通过磁分离将最终产物（图1A）与水溶液分离，并用纯水进一步洗涤直到达到中性pH。然后将SAMNP以10mg/mL的浓度分散在纯水中。图1A显示了分散在水中的大致10nm的SAMNP的TEM图像。

对相同样品的动态光散射分析显示合成的SAMNP具有高单分散性，并具有〜122.7nm的流体动力学直径。

zeta电位分析证实水中的zeta电位为38.1mV，数值未显示。 当zeta电位在-30mV和 30mV之间的时候，样品通常倾向于聚集，因为更高的zeta电位导致颗粒之间更大的静电排斥，使聚集最小化。 Unal等人，通过羧酸氧将SA化学吸附在Fe3O4纳米颗粒上 ，它们对称结合在Fe3O4纳米颗粒表面，由于暴露的OH基团，这些颗粒容易分散在水中。

生产水溶性好且可在水中呈单分散的纳米复合材料是一种愿景，因为它在生物医学应用和治疗中具有重要的意义，可目前其他形式的MNP还不能实现。 SAMNPs由于具有高表面积/体积比。呈现出均匀分布和高分散性，使得使用这些颗粒的进行细胞和DNA相关的实验比其他方法更具有更大的优势。

如下进行从HeLa细胞培养基中进行基因组DNA（gDNA）的纯化。 HeLa细胞在加有10％FBS，2mM谷氨酰胺，100U / mL青霉素和10ug/ mL链霉素的DMEM中，37℃的5％CO 2培养箱中生长。 当细胞达到约80％融合时，加入1mL胰蛋白酶以使粘附的细胞在37℃悬浮3分钟，并用另外的培养基终止胰蛋白酶消化。 用血细胞计数器测定细胞浓度为〜5times;105个细胞/ ml。 没有特定的甲硫氨酸，随后的实验使用相同浓度的细胞。 然后将细胞转移至含有10uL SAMNP的1.5mL管中。

将混合物在室温下孵育5分钟以形成细胞 - 纳米颗粒复合物，然后将其固定在磁力分离架上，随后吸出上清液，然后弃去。 在室温孵育之前，通过加入50 uL裂解缓冲液（3M NaI; 5M尿素; 40g/LTriton X-100; 10nM EDTA，25nM Tris-HCl，pH6.5）裂解固定细胞持续5分钟。 向悬浮液中加入50 uL促进释放的DNA与SAMNP结合的异丙醇（并在室温下温育3分钟）。 磁分离DNA-纳米颗粒复合物后，弃去上清液，用100 uL冷的70％乙醇溶液冲洗被固定的DNA一次。

除去乙醇并蒸发后，使用20 uL TE缓冲液（10mM EDTA，25mM Tris-HCl，pH8.0）中于室温下对DNA进行洗脱，时间为10分钟。 必要时进行RNase消化。 然后将SAMNP固定，将上清液转移到不含DNase / RNase的EP管中用于进一步分析。 将所得结果将与传统的苯酚 - 氯仿萃取法进行比较。每组实验重复三次。

如图2所示，用TEM表征SAMNPs捕获的细胞，图像采用CM-100仪器在80 kV下操作获得。与我们以前使用羧基包被的MNP提取尿液DNA的研究相比， SAMNPs收集细胞的收集率较高，因为细胞培养基中存在的细胞与尿中的细胞相比更多。 通过血球计测定固定化细胞与培养基中细胞的比例为68％。 图2清楚地显示SAMNPs附着于HeLa细胞的表面; 有些甚至进入细胞膜中。

应该注意的是，SAMNPs随机沉积在哺乳动物细胞表面，其方式类似于羧基包裹纳米颗粒 ，表明它们相互作用的非特异的。通过SAMNP对细胞的高捕捉率推测它从样品中提取基因组DNA时也具有高提取率。

在最初的裂解过程中，附着于细胞表面的SAMNPs不需要被去除，因为SAMNP-细胞复合物可以被直接裂解。 对于DNA提取，使用相同的MNP。 加入等体积的异丙醇以形成DNA /纳米颗粒复合物。 由于哺乳动物细胞的富集和gDNA的吸附都可以用相同的纳米粒子来实现，因此细胞培养基或细胞裂解物中存在的许多残留杂质和酶抑制剂可以容易地去除。

由于DNA和SAMNPs的非特异性相互作用，所以可能有蛋白质与SAMNPs的结合，导致DNA纯度下降。 然而，对经过TE缓冲液中洗脱得到的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳证表明可以忽略蛋白质的存在，如图3A所示。 用分光光度计测定10,20,50和100 uL哺乳动物细胞培养基中的gDNA浓度，分别为66.7,90.2,149.0和160.6mu;g/mu;l。 OD260 / OD280比率介于1.79至1.83之间，这也表明提取的gDNA的纯度很高。 传统苯酚提取过程中提取的gDNA显示出类似的DNA片段电泳图谱，但产量较低，这与以前的研究一致。

通过PCR检测提取的基因组DNA的质量，引物有四种，分别代表染色体上四种不同长度的DNA片段 。 扩增反应的终体积为25 uL，其中含有12.5 uL 2times;PCR主混合物，1 uL提取的DNA模板，正反PCR引物各1 uL，纯水1 uL。 四种不同长度的DNA片段扩增条件相同：95℃5分钟，94℃进行34个循环60秒，53℃30秒，72℃60秒，72℃最后延伸5分钟。

将最终的扩增子（5 uL）加到TBE缓冲液中的2.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，其条带在RGB染色的紫外光下可见。

使用PCR扩增得到的四种基因（K-ras，GAPDH，CYP3A4和GDF5）的大小在214-1106bp，如琼脂糖凝胶图（图3B）所示。 PCR反应显示出极好的一致性，验证了本方法提取的DNA的高质量。 所有阴性对照在凝胶图像中均未显示。 所有的PCR模板都使用了通过50 uL HeLa细胞悬浮液，20 uL TE缓冲液洗脱得到的DNA溶液1 uL。 为了进一步研究，加入不同样本体积（10,20,50和100 uL），通过PCR测试扩增GAPDH基因的情况如图3C（I）所示。 如预期的那样，随着样品体积的增加（从10至50 uL），PCR带的强度变得更强。

因为SAMNPs对哺乳动物细胞具有高结合亲和力，所以提取效果不错。 我们的研究结果表明所开发的方法适用于小规模DNA的提取，可以进行后续PCR操作。 另一组PCR反应也使用1 uL从100 uL悬浮液中提取的5,25,125和625倍稀释的gDNA。 如预期的那样，随着稀释度增加（从5至625），PCR条带的强度变得更弱。

我们的研究中值得注意的是，我们简化了用于PCR的DNA模板的制备过程，因为MNP可以目标性的分离和富集细胞群体。从100和200 uL培养基中获取的DNA模板可以成功的应用于GDF5基因（1106bp）的PCR扩增（图3C）。 阴性对照没有任何DNA模板。需要注意的是附着在细胞膜上的纳米颗粒不会对PCR扩增产生任何不利影响 。 此外，整个过程可以在7分钟内完成，对于快速简单的PCR的筛选非常重要。

总之，实验表明SAMNPs是用于gDNA纯化的优异固相载体。与其他的用于DNA提取的功能化MNP固相载体相比，SAMNPs的制备更简单，不需要复杂的表面包被步骤。我们的方法采用绿色化学方法，在整个过程中我们都试图减少或消除危险/有毒化学品的使用或产生。合成的SAMNPs可以非特异性结合分离哺乳动物细胞，并可以一步结合释放的gDNA以完成提取。整个过程可以在30分钟内完成，并且可以在一个管中完成提取。因此，所开发的方法可称为“单管，一步式基因组DNA提取”，不需要复杂的样品制备或处理，或使用有害试剂如苯酚或氯仿。与离心等其他方法相比，对设备的要求更低，并且非常适合常规生化或临床筛选。

使用二氧化硅包裹的磁性纳米粒子从大肠杆菌BL21中同时提取DNA和RNA

核酸的提取被认为是分子生物学中最重要的步骤之一，是其他下游应用的基础，如测序，扩增，杂交和克隆。目前有许多商业试剂盒和方法可用于仅提取一种类型的核酸：DNA或RNA。然而，在临床同时检测几种疾病的情况下，需要从同一样品中同时提取DNA和RNA 。在这项研究中，描述了基于磁性纳米颗粒（MNPs）从细菌中同时提取DNA和RNA的方法。制备裂解缓冲液以帮助核酸释放并吸附至MNP。然后，使用两种洗涤缓冲液来去除蛋白质和碳水化合物的污染。最后通过脱氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）溶液来洗脱核酸。研究可能影响核酸纯化的因素，并记录核酸的产量和质量。分别对从细菌提取的DNA和RNA进行聚合酶链式反应（PCR）和逆转录PCR（RT-PCR）以进一步确认其质量。结果表明，我们的方法可以成功地用于从细菌中同时提取DNA和RNA。

关键词：核酸，同时提取，磁性纳米颗粒（MNPs），细菌

核酸的提取被认为是分子生物学中最重要的步骤之一，是其他下游应用的基础，如测序，扩增，杂交和克隆。 近年来，核酸提取方法发展迅速，其中磁性纳米颗粒（MNPs）法因操作简便，成本低，受到了广泛的关注和重视 。 此外，因为使用MNPs提取处理时间较短，易于自动化，使用的化学试剂更少，这种方法显示出很大的优势。通常的核酸分离方法会涉及到多步的离心，耗时较长，分离产率和纯度较低，不适合于自动化和大样品量提取。 因此，功能化的磁性纳米粒子被开发并用于从不同材料（处在合适的缓冲液中）中快速高效提取已经释放出来的核酸。

目前许多商业化的试剂盒只允许提取一种核酸DNA或RNA 。然而，在特定的疾病临床检测中总是需要一种快速可靠的从同一样品中同时提取DNA和RNA的方法。因此，开发 从同一样品中同时提取DNA和RNA的方法是非常紧迫的，这将为同时检测不同疾病奠定基础 。在这项研究中，开发和优化了MNP提取法，将其应用于从同一个大肠杆菌样品（大肠杆菌）中DNA和RNA的同时提取。优化了裂解缓冲液 ，乙醇用量，MNPs用量和可能影响核酸产量的洗涤缓冲液等因素。进行聚合酶链式反应（PCR）和逆转录PCR（RT-PCR）以验证提取的DNA和RNA的质量。获得的DNA和RNA可用于后续应用。

结果与讨论

裂解缓冲液 ，乙醇用量，MNPs用量和洗涤缓冲液的优化

细胞裂解，作为核酸提取的第一步 ，受裂解缓冲液的体积和盐浓度的影响 。 如图1（a）所示，裂解缓冲液的盐浓度较低，体积较少时， 不能裂解大肠杆菌所有的细胞壁，而600mu;L裂解缓冲液B足以分解所有大肠杆菌，释放核酸。 随着裂解缓冲液的体积和盐浓度的增加，核酸提取产量上未显示出明显的变化。当裂解缓冲液的盐浓度较高的时候，可用于溶解DNA的游离水的量就会减少。 此外，通过添加Gu·HCl来降低溶液中游离水的浓度会导致DNA-二氧化硅复合物的形成 。

乙醇的作用是作为结合缓冲液，促进核酸的聚集和沉淀。DNA和RNA 在乙醇环境中是比较稳定的。 图1（b）表明，随着乙醇加入量从20

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