滇池水华束丝藻毒素对斑马鱼鳃的呼吸毒性外文翻译资料

 2022-06-14 09:06

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摘要：来自滇池水华束丝藻的束丝藻毒素在世界范围内的富营养化水体中经常被发现。这些毒素可以产生麻痹性贝类毒素（PSPs），严重危害了环境安全和人类健康。虽然已经对神经毒性水华束丝藻毒素的分子机制进行了研究，但仍然存在许多问题，例如由这些神经毒素诱导的在体内发生的鳃组织学和神经递质失活的改变等相关问题需要进行研究解决。我们通过高效液相色谱法测定从滇池水华束丝藻的天然分离株提取的水华束丝藻毒素，发现分离出的束丝藻毒素的基本成分分别是膝沟藻毒素 1（GTX1），膝沟藻毒素 5（GTX5）和新石房蛤毒素（neoSTX），它们分别占总含量的34.04%，21.28%和12.77%。通过对斑马鱼（Danio rerio）进行腹膜内注射含有5.3mg或7.61mg STX当量（eq）/ kg（分别为低剂量和高剂量）的滇池水华束丝藻毒素，然后在处理后24小时研究斑马鱼鳃中的组织学改变和神经递质失活的变化情况。斑马鱼经过束丝藻毒素处理后，鳃中丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）的活性显著增加，且在第一次处理的12小时期间鳃的组织学改变，这表明该毒素诱导鳃的功能和结构损伤；进一步研究发现鳃组织的乙酰胆碱酯酶（AChE）和单胺氧化酶（MAO）活性受到显著抑制，这表明斑马鱼鳃组织中的神经递质传递发生了失活的变化。我们观察到，鳃结构和功能的改变遵循时间和剂量依赖性模式。本研究结果表明，束丝藻毒素或PSPs导致斑马鱼鳃组织的结构和功能改变，这些变化包括组织结构的改变和AST和ALT活性的增加，以及鳃组织的AChE和MAO活性的抑制，都表明了束丝藻毒素或PSPs具有诱导斑马鱼鳃组织的呼吸毒性。此外，以上这些参数可作为研究自然水体中束丝藻毒素和蓝藻水华的生物学标准物。

关键词：束丝藻毒素；乙酰胆碱酯酶；组织学；单胺氧化酶；呼吸毒；斑马鱼鳃

1、引言

由水华束丝藻（A. flos-aquae）占主导地位的蓝藻水华被认为是世界范围内的严重问题，许多国家已经报道了这一点。水华的主要危害是因为水华束丝藻的优势菌株可以分泌对水生生态系统产生有害影响的蓝细菌-神经毒素或麻痹性贝类毒素。自2006年以来，在滇池就发现了以滇池水华束丝藻为主的蓝藻水华。滇池一直向中国云南省昆明市附近的当地居民提供饮用水、农业、娱乐和旅游用水，而水华和蓝藻内生神经毒素或其产生的麻痹性贝类毒素有严重的毒性，所以这些水华的繁殖危害了环境安全以及湖泊附近居民的健康。

PSPs是强有力的生物碱神经毒素，主要存在于海洋，它们是由海水中的鞭毛藻产生的，但是淡水蓝藻和细菌也可以产生PSPs。高浓度的PSPs可以累积在水生动物身上，但对这些动物的负面影响不大。然而，当人类或动物食用这些被污染的水生动物时，累积的PSP可能导致神经毒性。另外，它们对热、酸和碱具有抵抗力，所以通过烹饪和过滤以及其他的正常食物制备方法都不能完全除去隐藏毒素或PSP。因此，有效减轻和治愈食用受污染动物食品导致的人体PSP中毒仍然是不实际的，人工呼吸和流体治疗才是唯一可用的措施。鱼类是水生食物链顶端的重要生物，所以基于它们在水生生态系统中的地位，鱼类可作为水生生态系统中总体系健康的重要指标。斑马鱼是水生生物系统的重要模式生物。以前的研究已经证明了PSP可以通过食用受PSP污染的食物吸收到鱼体内。以往对鱼类的研究表明，PSPs被吸收后在肌肉中积累，可影响发育，引起幼鱼变形和死亡，影响游泳能力，导致脑和肝脏结构和功能的变化，这表明 PSPs或束丝藻毒素对鱼有毒害性。

鳃是鱼类的气体交换、渗透调节、酸碱平衡和含氮废物排泄相关的最重要的器官。鱼的鳃为毛细血管中的血液与外部环境之间的交流提供了很大的表面积，同时也是将污染物吸收到体内的重要器官。因此，鳃中经常会发生直接污染物或毒物引起的改变。所以，鳃结构和功能可以作为环境变化的重要生物标志物。谷氨酸转氨酶（ALT），天冬氨酸转氨酶（AST）和鳃中的组织学变化这几个重要参数已被用于评估鱼类中毒物对鱼类毒性的影响。乙酰胆碱酯酶（AChE）和单胺氧化酶（MAO）是分解鱼鳃中胆碱能神经递质和单胺神经递质的两种重要酶，例如分别由副交感神经产生的乙酰胆碱和来自交感神经的去甲肾上腺素/肾上腺素。以前的研究报道了由杀虫剂和毒物引起的鱼鳃中这些参数的变化情况。然而，由蓝藻细菌神经毒素或PSPs引起的鱼鳃中上述参数的变化相关的研究相对较少。

本研究的目的是研究作为呼吸毒性和神经毒性指标的鳃组织学、ALT、AST、AChE和MAO在斑马鱼鳃接触亚致死浓度的滇池水华束丝藻毒素或PSPs 后24小时的变化。这项研究的结果将进一步揭示鱼鳃在呼吸到蓝藻神经毒素或PSPs后的呼吸功能的变化情况。

2、材料和方法

2.1、化学药品

麻痹性贝类毒素标准物包括蛤蚌毒素（dcSTX，STX，neoSTX）和金尼克酸类毒素（GTX1-5，dcGTX2,3），购买于加拿大国家研究委员会（哈利法克斯，新斯科舍省，加拿大），其他所有的化学试剂除特别说明外，均为国家标准品。

2.2、毒素制剂

制备样品A. flos-aquae DC-1采自中国滇池蓝藻水华。将A. flos-aquaeDC-1培养于无菌BG11培养基中，通过离心（6000g，10℃，10min）收集并储存于-20℃，以供将来分析。

使用0.01M乙酸溶液作为载体，从培养的水华束丝藻中提取毒素2次，使用旋转蒸发器通过一系列沉积，过滤和蒸发浓缩纯化毒素，最终通过seppak C18墨盒(Waters, Milford, MA, USA)。

使用LC20A高性能液相色谱（HPLC）系统（Shimadzu，Kyoto，Japan）进行毒素检测和荧光检测（LC20A，RF-10AXL，Shimadzu），使用Shimadzu Class-CR10软件分析数据（Shi-madzu）。

通过比较色谱图和参考标准来检测从滇池水华束丝藻细胞中提取的STX和GTX。通过注射参考标准完成的因子应答（峰面积/毒素浓度）计算毒素浓度。根据毒素的量及其与STX相比的相对毒性，提取的毒素的毒性以STX当量计算。纯化毒素，在-20℃冷冻，以备未来的毒性研究。

2.3、毒素剂量的选择

所有动物实验符合动物程序、国际标准和道德委员会的认可。

参考先前列出的方法来选择所用毒素的剂量。总共使用了大约300只斑马鱼。简言之，使用含有提取的束丝藻毒素的50mL一次性无菌微量注射器给每条鱼进行腹膜内注射（5mL，6.4mgSTX当量/ kg体重）。如果处理后的鱼在24小时内死亡，则另一只鱼用较低剂量的束丝藻毒素（用0.01M乙酸溶液稀释）处理;如果斑马鱼在24小时内没有发生死亡，另一只鱼就注射更高剂量的束丝藻毒素。该过程持续进行，直到处理的鱼存活24小时。最终选择两种不同的注射剂量：5.3微克和7.61微克STX当量/ kg体重，分别作为低剂量和高剂量。选择较低的剂量是基于无死亡时观察到与毒性相关的明显行为变化，而选择较高剂量是因为在低死亡率（30%）存在下所有注射毒素的鱼都发生严重的行为改变。对照组斑马鱼单独注射0.01M乙酸溶液。

2.4、束丝藻毒素注射和样品采集

本实验采用的国家斑马鱼（D. rerio）来自重点实验室斑马鱼中心（武汉，中国），共105只，均为健康的雄性斑马鱼。这些鱼来源于同一批受精卵，并在相同的条件下培养。适应7天后，将斑马鱼随机分为对照组、低剂量组和高剂量组。低剂量组和高剂量组的鱼通过腹膜注射30mu;L0.01M乙酸，低剂量组注射含有5.3GSTX eq / kg的束丝藻毒素，高剂量组注射含有7.61GSTX eq / kg的束丝藻毒素。对照组注射30mu;L0.01M乙酸溶液。在处理后1,3,6,9,12和24小时，将每个处理组的五条鱼埋入-8◦C冰粒杀死。取出鳃，在液氮中快速冷冻，然后存储在-n◦C分析生理参数，或者固定在10%中性甲醛中用于组织学分析。根据考马斯亮蓝G-250方法测量鳃提取物的蛋白质浓度。实验重复三次。

2.5、鳃组织学研究

根据其他作者使用的技术进行组织学分析。把斑马鱼鳃先放置在10%的中性甲醛溶液中超过24小时，然后在流水中冲洗超过24小时，再在乙醇梯度系列中脱水，最后在二甲苯中进行脱水并包埋在石蜡中。将固定和嵌入的鳃样品切片（6mu;M），用苏木精-伊红染色，并在Nikon显微镜（Eclipse 80i）下分析，同时使用Nikon数码相机进行显微照相(DS-U3-Ri1)。

从每组取5条鱼检查组织病理学异常，从每只鳃中随机选取10个切片，每个部分分析五个指标。进行半定量评估，其中记录每个鳃中检测到发生变化的薄片和细丝的数量，并确定每种异常的具体类型的发病率，这是以百分比的形式表示的（对于每个选定部分的总薄片特定的层状损伤）。为了保持评估的一致性，所有切片在400times;光学显微镜下进行观察并拍照。每个区域中平均每个鳃包含40个薄片（平均三根细丝）。（ - ）表示没有变化；（1-10%，0 ）表示轻微变化；（11-30%， ）表示轻度变化；（31-50%， ）表示中度变化；（51-70%， ）表示严重变化；（71-100%， ）表示更剧烈的变化。

2.6、生理参数的检测

根据生产商的说明，使用商业试剂盒（南京建成生物工程研究所，南京，中国）测定ALT，AST，AChE和MAO的活性。使用96孔微量滴定板作为测量反应的试剂盒，AST和ALT的酶活性以每毫克蛋白质活性单位（U / mg蛋白质）表示。AChE的一个酶活性单位（U）被定义为在6分钟内每种蛋白质水解1摩尔时反应底物所需的活性（U / mg蛋白质）。MAO的一个酶活性单位计算为在37°C（U / mg蛋白质）下将反应吸光度增加0.01的活性。所有测定均平行测定三组。

2.7、统计分析

使用SPSS统计软件（SPSS 16.0，Chicago，IL，USA）分析数据。ALT，AST，AChE和MAO的活性以及组织学数据用三个独立实验的平均值表示。通过单向方差分析结合最小显著差异，事后检验评估组间统计学显著性差异。当P lt;0.05时差异被认为是显著的，当P lt;0.01时差异是高度显著的。

3、结果

3.1、毒性分析

高效液相色谱分析发现从束丝藻中提取的毒素含有三种毒性成分：neoSTX，GTX1和GTX5，按照各自的对照标准有相同的迁移率。滇池水华中的麻痹性贝类神经毒素的浓度为9.52ng/mg干重。根据GTX1，GTX5和neoSTX与STX的相对毒性比，毒素的总毒性为STX eq / mg干重的6.51。高效液相色谱法证实提取的毒素纯度为69.57%，GTX1占主要成分，含量为34.04%，GTX5和STX分别占21.28%和12.77%。

3.2、斑马鱼鳃中ALT活性的变化

与对照组相比，实验组斑马鱼鳃的ALT活性显著增加（P lt;0.05）。毒素处理3-12小时后，低剂量组和高剂量组平均ALT水平分别比对照组高1.76倍和1.94倍。在给药1小时后鳃的ALT活性增加，并在给药后3-12小时进一步增加。在12小时后观察到最大的ALT活性，其中低剂量组和高剂量组的平均增加量分别是对照的2.0倍和2.29倍。毒素处理后的鱼鳃的ALT活性在24小时后逐渐恢复（图1）。

3.3、斑马鱼鳃中AST活性的变化

与对照组相比，实验组斑马鱼鳃的AST活性显著升高（P lt;0.05）。注射毒素3-12 h后，低、高剂量组平均AST活性分别是对照组的1.68倍和1.89倍。在注射毒素后1 h后鳃丝中AST活性增加，3-12 h后继续增加。 在12小时观察到最大AST活性，此时低剂量组和高剂量组分别平均增加1.96倍和2.27倍。实验组鱼的AST活性在24小时后逐渐恢复（图2）。

3.4、鳃组织学结构的变化

对照组斑马鱼鳃的组织学结构正常，而实验组的斑马鱼鳃组织结构发生改变。表1和2中总结了组织病理学发现，图3和图4表明典型的鳃损伤。实验组鱼在注射毒素1小时后开始出现变化，包括充血、水肿、鳃丝和薄片的弯曲、薄片的增厚和解除、坏死以及薄片上皮细胞的脱落。然而，与对照组相比，在注射毒素后3小时和12小时之间可观察到更明显的差异，低剂量组和高剂量组细丝中的平均损伤分别为32.94%和35.16%，在切片分别中为35.01%和38.07%（P lt;0.05）。充血的细丝发生改变，低剂量组和高剂量组变化情况分别是33.47%和35.23%。与对照组相比，低剂量组与高剂量组的其他改变有：电汇线性（36.5%和36.1%），细丝增厚（35.4%和29.93%），细丝脱落（26.38%和39.41%），层状充血（35.08%和37.06%），层状水肿（35.49%和35.13%)，层状弯曲（35.74%和35.5%），板层增厚（35.06%和36.49%），板层抬升（34.75%和37.5%），上皮坏死（32.75%和41.51%）和上皮脱落（36.19%和43.28%）。

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