固定化多形汉逊氏菌的甲醛代谢酶，用于去除和控制空气中的甲醛外文翻译资料

 2022-08-09 09:08

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固定化多形汉逊氏菌的甲醛代谢酶，用于去除和控制空气中的甲醛

摘要：

含甲醛（FA）的室内空气对人体健康有不利影响，应通过密集通风或催化转化为无毒产品的方式除去。FA可以被醇氧化酶（AOX）氧化，参与甲基营养酵母的甲醇代谢。在本工作中，测试了从葡萄糖培养基中过量生产这种酶的多形汉逊酵母C-105突变体（gcr1 catX）分离出的AOX氧化空气FA的能力。 设计了连续流化床生物反应器（FBBR），以通过AOX或固定在藻酸钙珠粒中的透化突变型多形汉逊酵母C-105细胞对机载FA进行有效的生物转化。固定化的具有6-8 U mg-1蛋白比活的AOX被证明可以保留初始活性的85-90％。 固定化酶的催化参数实际上与游离酶相同（kcat / Km分别为2.35times;103 M-1 s-1与2.89times;103 M-1 s-1）。 结果表明，当通过固定化AOX在1.3–26.6 U g-1范围内的凝胶中鼓吹含有0.3至18.5 ppm FA的空气时，会导致出口气相中FA浓度显着降低（小于0.02– 0.03 ppm，即比阈限值低10倍）。还证明了固定化透化C-105细胞的FBBR可以消除90％以上的机载FA。 该过程由特制的酶安培生物传感器进行监控，该传感器基于FA的NAD 氧化和来自重组多形汉逊酵母Tf 11-6菌株的谷胱甘肽依赖性甲醛脱氢酶。

缩略语：
FA，甲醛； AOX，醇氧化酶； FdDH，甲醛脱氢酶； GSH，还原型谷胱甘肽； MB，梅多拉蓝色； MBTH，3-甲基-2-苯并噻唑啉酮盐酸盐; TLV，阈值极限值； MSDS，材料安全数据表； PMSF，苯甲基磺酰氟； CTMAB，十六烷基三甲基溴化铵； FBBR，流化床生物反应器

关键词：
甲醛; 醇氧化酶； 酶固定化； 流化床生物反应器； 重组甲醛脱氢酶； 生物传感器测定

1.简介
甲醛是一种非常重要的商业化学品，并且是许多行业中使用的毒性最高的污染物之一。 它在压制木制品中用作粘合材料，在油漆和涂料中用作防腐剂，在肥料，纸张，胶合板和脲醛树脂的生产中以及在许多其他应用中使用（Yocom和McCarthy，1991，Khoder等人。 （2000年，Otson和Fellin，1992年）。 FA作为消毒剂和组织硬化剂被引入医学实践，并在医院和实验室中广泛用于保存组织标本（Walker，1964； Cox，1994）。 它也被用作疫苗生产中的消毒剂和防腐剂（Geier和Geier，2004； Offit和Jew，2007）。

体内FA的排毒主要是通过FdDH（EC 1.2.1.1）进行的，FdDH是一种特殊的酶，在GSH和NAD 存在下（Pourmotabbed和 Creighton，1986年； Uotila和Mannervik，1979年）。 FdDH广泛用于生物分析目的（Ali等，2006; Gonchar等，2002;Hauml;mmerle等，2010; Herschkovitz等，2000; Kawamura等，2005; Korpan等，1993; Korpan等，2000； Vastarella和Nicastri，2005； Winter和Cammann，1989）。

FA的水合形式可以很容易地被AOX（EC 1.1.3.13）氧化成甲酸，而无需任何外源性辅助因子，AOX是一种负责体内甲基营养酵母中甲醇代谢的第一反应的酶（Kato等人，1976，Klei）

据认为，暴露于空气中20 ppm FA对生命和健康是危险的。已经提出了几种从室内空气中去除FA的方法。活性炭对FA的物理吸附（Boonamnuayvitaya等，2005； Tseng等，2005），各种馏分的松松树皮（Takano等，2008）和沸石（Cazorla和Grutzeck，2006）被证明具有良好的吸附作用达到很高的效果。但是，简单的吸附不能为该问题提供根本的解决方案，因为FA不会分解，而只会从一相（空气）转移到另一相（固体）。在光催化，负离子和臭氧空气净化器的帮助下进行物理FA分解的尝试最多只能消除50％的FA，并且未能提供符合WHO准则（0.08 ppm）的FA水平（Tseng等， 2005年）。胺基官能化的复合二氧化硅颗粒和铂纳米颗粒对FA的化学分解显示出非常高的FA去除能力（Lee等，2008）。但是，这种方法很昂贵。 Sekine开发了另一种化学消除空气中FA的方法，其中二氧化锰被证明对FA氧化有效（Sekine，2002； Tian and He，2009）。空气中的甲醛-甲醇混合物在Mn / Al2O3和Pd-Mn / Al2O3催化剂上燃烧可显示出有机化合物的完全转化（Aacute;lvarez-Galvaacute;n等，2004）。 FA分解的化学方法具有很高的效率，但是在这些过程之后残留的固体废物通常含有有害的有毒成分，这会导致后续的利用问题

利用生物分解从空气中去除FA的方法尚不完善。 测试了几种含有天然微生物的生物滤池和生物滴滤池对甲醛和甲醇混合物的处理（Prado等，2004； Prado等，2006）。 FA的最大消除能力达到180 g m-3 h-1。

据我们所知，基于酶的生物反应器尚未经过测试，可以作为室内空气中FA生物修复的潜在工具。 本工作的目的是研究使用酶AOX以及过量生产该酶的多形酵母H. polymorpha细胞来设计用于机载FA催化氧化的连续生物反应器的可能性。 为了对该过程进行定量监测，将构建基于重组NAD 和GSH依赖性FdDH的FA选择性安培生物传感器。

2.材料和方法
2.1 化学制品
DEAE-Toyopearl 650M购自Toyo Soda（日本东京）； 多聚甲醛，Triton X-100，PMSF，变色酸，MBTH，MB和藻酸钠得自Sigma-Aldrich（美国）； CTMAB和GSH购自Fluka（瑞士Buchs）。 NAD 和NADH购自Gerbu Biotechnik（德国盖尔贝格），1％Nafion乙醇溶液（德国Aldrich），阴极电泳漆“ GY 83-0270 0005”购自BASF Farben und Lacke（德国Munster）。
所有化学药品均为分析试剂级，所有溶液均使用HPLC级水制备。 FA溶液（1 M）是通过将相应量的多聚甲醛（Sigma-Aldrich，美国）在水（300 mg； 10 ml水）中水解，然后将其在密封的安瓿瓶中于105°C加热6 h来制备的 。

2.2 突变和重组酵母菌株
两个多形汉逊酵母突变体的透化细胞被用作构建细胞生物反应器的生物活性材料：（1）CSA-33（gcr1）（“酒精氧化酶的组成性合成”），葡萄糖分解代谢物抑制AOX合成的能力减弱。 后一菌株也用作AOX分离的来源。
我们先前构建的重组多形汉逊酵母Tf 11-6菌株用于分离热稳定的NAD 和依赖谷胱甘肽的FdDH（Demkiv等，2005）。

2.3 酶活性测定
如先前所述（Shleev等，2006）测量AOX活性。
FdDH活性是通过以下条件在340 nm下分光光度法监测的NADH形成速率确定的（Schutte等，1976）：25°C，1 mM FA，1 mM NAD 和2 mM GSH的PB（50 mM磷酸盐 缓冲液，pH 8.0）。 FdDH（A）的即时活性计算为A FA（存在FA）和A-FA（不添加FA）之间的差异。
两种酶的活性单位（1U）定义为在标准测定条件下每1分钟形成1mu;mol产物的酶量。
通过Lowry方法估计蛋白质浓度。

2.4 酶的分离和纯化

2.4.1 来自过量生产的多形汉逊酵母酵母细胞的AOX
从在葡萄糖培养基中培养的酵母多形汉逊酵母C-105（gcr1 catX）菌株的无细胞提取物中分离出AOX（Gonchar等，2001； Shleev等，2006）。 在存在1 mM EDTA和0.4 mM PMSF的情况下，用硫酸铵（饱和度为40％和60％）进行两步沉淀来纯化酶，以抑制蛋白酶。 饱和度为40％时，弃去蛋白质沉淀物，并通过离心收集饱和度为60％时获得的AOX

2.4.2 重组FdDH

为了分离酶，将重组多形汉逊酵母Tf 11-6菌株的细胞在5 mM FA存在下于1％甲醇培养基中培养（Demkiv等，2007）。
纯化程序包括制备无细胞提取物，并在阴离子交换吸附剂DEAE-Toyopearl 650M上进行两步柱色谱分离（Demkiv等，2007）。 用于生物传感器构建的酶的最终比活为18 U mg-1蛋白。

2.5 基于AOX的生物反应器
2.5.1 海藻酸钙凝胶中AOX的固定化
将活性为2、10、20或40 U ml-1的0.05 M PBS，pH 7.5（缓冲液A）中的1 ml AOX溶液等分试样与2 ml 3％（w / v）海藻酸钠混合。 使用具有21G针头的注射器在室温搅拌下将混合物滴入2.5mM CaCl 2水溶液中，并保持45分钟以形成珠。 将获得的凝胶珠用20 ml缓冲液A洗涤两次。

2.5.2 将酵母细胞固定在藻酸钙凝胶中
在1 ml缓冲液A中稀释30 mg透化的多形汉逊酵母突变体C-105细胞（AOX活性0.2 U mg-1）和CSA-33（活性0.08 U mg-1）的悬浮液，并与2 ml 3 ％（w / v）藻酸盐，并如上所述处理以固定AOX。
酵母细胞的通透性通过在30°C下用0.1％CTMAB处理30分钟进行。 通过离心除去通透剂，并用10 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）洗涤细胞。 使用前，将透化的细胞冻干或在室温下干燥。

2.5.3 游离和固定化AOX酶参数的确定
使用常规的Lineweaver-Burk方法确定游离和藻酸盐固定的AOX的Michaelis-Menten常数Km和催化常数kcat。
2.5.4。 FA氧化和连续FBBR测定气相和液相FA

将固定有AOX（1.3–26.6 U g-1）或细胞（20 mg g-1）的凝胶珠子应用到与空气连接的1 cmtimes;30 cm色谱柱（20 ml缓冲液A中的1.5 g珠子）上源具有已知的FA浓度。通过使用多通道Ecoline蠕动泵（瑞士Ismatec）在2.7–100 mM的FA水溶液中于25°C鼓入7–132 ml min-1的气流，从而获得了空气中0.3–18.5 ppm的FA浓度。放大后的FBBR是在10 cmtimes;25 cm色谱柱的基础上设计的，在750 ml缓冲液A中包含37.5 g含AOX的藻酸盐凝胶珠（6.6 U g-1），连接到具有18.5 ppm空气源的空气FA以152 ml min-1的气流鼓泡。根据亨利定律（Seyfioglu和Odabasi，2007）计算塔入口处气相中的FA浓度，并用甲醛气体检测仪（日本FP-40 Riken Keiki型）进行测试。用相同的检测器测试塔出口处气相中的FA浓度。 FBBR中液相中的FA浓度是通过标准的光度法使用与1％变色酸的反应来测定的（Sawicki等，1961），以及本文所述的基于电流法的基于FdDH的生物传感器。对照柱包含无AOX或细胞的珠。

2.6 基于FdDH的安培生物传感器
2.6.1 FdDH修饰的生物电极的构建
来自DropSens（西班牙奥维耶多）的镀铂丝网印刷金电极（C220AT型，直径4.0毫米）用作工作电极。 通过循环伏安法（-0.6至0.4 V vs Ag / AgCl / KCl，扫描速度为50 mV s-，在6 mg ml-1的六氯铂（IV）-酸六水合物水溶液中对金电极进行镀铂） 1、3-4个周期）。 镀铂后，用pH 8.2的20 mM磷酸盐缓冲液冲洗电极

电沉积的MB被用作介体，以提供从还原的FdDH通过辅酶到工作电极的最佳电子转移。 MB的固定化是通过循环伏安法（相对于Ag / AgCl / KCl为-0.4至0.4 V，扫描速率为50 mV s-1，进行4-5个电势循环）进行的。电沉积MB后，将MB修饰的电极用pH 8.2的20 mM磷酸盐缓冲液冲洗。
FdDH及其辅因子（NAD ）的固定是使用商用阴极涂料（GY 83-0270 0005; pH 5.5）进行的，以形成生物识别层。将2mu;lFdDH悬浮液（30 U ml-1; pH 8.2）和2mu;l100 mM NAD 滴在MB修饰的镀铂电极的表面上，然后加入8mu;l阴极稀释液的10倍稀释液油漆解决方案。干燥后，形成粘附良好的聚合物膜。为了共同包裹第二辅因子谷胱甘肽，并用Nafion膜覆盖传感层，将4mu;l中和至pH 8.0的50 mM GSH溶液滴在FdDH和NAD 修饰电极的顶部。干燥（2-4分钟）后，将5mu;l的1％Nafion溶液（商品乙醇溶液用水稀释）放在传感器表面。将Nafion膜在 4°C下干燥20–25分钟。使用前，将构建的生物电极用pH 8.2的20 mM磷酸盐缓冲液冲洗。

2.6.2 安培测量
基于FdDH的电流型生物传感器的特性是在具有Ag / AgCl / KCl（3 M）参比电极和Pt-wire反电极的三电极配置中使用恒电位安培法进行评估的。 使用恒电位仪CHI 1200A（IJ Cambria Scientific Ltd，Burry Port，英国）进行安培测量，并在室温下使用标准20 ml电池在连续搅拌下以间歇模式进行。 在背景电流稳定之后，通过使用在20 mM磷酸盐缓冲液，pH 8.2（用于校准）中制备的储备溶液和生物反应器出口液的等分试样添加甲醛等分试样来开始实验。
实验之间将修饰的电极在4°C下于20 mM磷酸盐缓冲液（pH 8.2）中存储。

2.7 光度FA测量
FA的化学分析通过变色酸（P

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