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钙离子直接与埃博拉病毒融合肽相互作用
促进增强感染的结构-功能变化
摘要：埃博拉病毒病周期性发作，高致死率和缺乏批准的治疗方法，已成为严重的全球性健康问题。一些细胞内钙改变的药物，特别是在内溶体中，已被证明能抑制埃博拉病毒感染；然而，其潜在机制尚不清楚。在这里，我们提供的证据表明，由于钙与EBOV融合肽（FP）的直接相互作用，在钙存在下促进了扎伊尔埃博拉病毒（EBOV）感染。我们发现FP中的糖蛋白残基D522和E540对埃博病毒与钙的相互作用具有重要的功能。我们通过光谱和生物物理分析表明，融合肽与Ca2 离子的相互作用导致膜融合过程中宿主膜中的脂质有序化，并且这些变化在低pH值下得到促进，并且可以与感染性相关。我们进一步利用圆二色光谱证明，钙与融合肽的相互作用促进了融合肽的alpha;螺旋结构，这是一种增强膜融合的构象变化，通过膜融合的功能测定得到验证。本研究表明钙直接作用于埃博拉病毒融合肽并影响其构象。由于这些残基在丝状病毒科中高度保守，钙对融合的影响，以及随后的感染性，是一种关键的相互作用，可用于制定预防埃博拉感染的策略。这一机制性的见解为钙干扰药物的使用提供了理论基础，这种药物已经被FDA批准作为治疗埃博拉病毒的药物，并使抗埃博拉病毒新药的进一步开发成为可能。
埃博拉病毒病是人类和非人类灵长类动物的出血热，平均致死率约为50％.2014年迄今最流行的疫情发生在西非，据报有近30,000例病例死亡，并有11,000多人死亡。 在当前的刚果民主共和国疫情中，有3000多人感染了该病。目前还没有食品和药物管理局批准的专门治疗埃博拉的治疗方法，尽管有疫苗在临床试验中，抗埃博拉病毒的抗病毒药物正在研发中。鉴于埃博拉病毒在全球健康中的重要性以及现有的少数对策，了解埃博拉病毒的生命周期以确定治疗干预的目标至关重要。
埃博拉病毒病是由埃博拉病毒引起的，埃博拉病毒是一种单链负义RNA病毒，属于丝状病毒科。埃博拉病毒基因组被包裹在来源于宿主细胞膜的脂质膜中。埃博拉病毒尖峰糖蛋白（GP）嵌入在这个包膜中，介导病毒进入，特别是受体结合和融合。GP是I类融合蛋白，可能在病毒组装过程中通过弗林蛋白酶进行蛋白水解引发，将pre-GP切割成包含亚基GP1和GP2的成熟形式。 GP不是典型的I类融合蛋白，因为它包含掺入较大二硫键环中的“内部”融合肽（FP）（图1d，e）。最初与细胞表面受体结合后，病毒通过巨胞饮或胞吞作用进入细胞。 组织蛋白酶在内体中切割出GP的一个糖基化区域，即糖基帽，然后该病毒能够结合其内体受体NPC1。与NPC1结合后，随后的触发条件导致GP发生构象变化，使病毒将其包膜与内体膜融合，从而释放病毒基因组。 这种融合触发的确切性质仍然未知。
在膜融合过程中，疏水性FP进入内体膜，这有助于脂质在病毒膜和内体膜之间混合。 GP中进一步的构象变化然后允许在两个膜之间形成孔以便于基因组逃逸。 埃博拉病毒FP位于非结构化环中，侧翼是带负电荷的残基。扎伊尔埃博拉病毒（EBOV）FP的NMR研究表明，它在中性和酸性pH下均具有柔性构象，但pH 7和5.5的结构不同，这表明pH在融合中可能发挥作用。
内体成熟过程中管腔pH值的变化是众所周知的。 但是，包括钙（Ca2 ）在内的其他离子的含量也会发生变化。 最初，内体中的Ca2 浓度迅速下降，但随后在内吞途径中增加，在晚期内体中达到2.5mu;M，在溶酶体中达到400mu;M。当前的埃博拉病毒进入模型是该病毒在同时包含NPC1和两孔Ca2 通道（TPC2）的溶酶体中进行融合，但是TPC2或钙离子在感染过程中的作用尚不清楚。 在这里，我们阐明了这一作用，并描述了一种机制，该机制指向在埃博拉病毒进入期间直接靶向融合肽的钙离子。 随着抗埃博拉病毒抗病毒药物搜寻的继续，我们的发现表明Ca2 破坏是一种强大的治疗工具，我们描述的机制使合理设计药物能够利用这种Ca2 依赖性。
结论：
Ca2 耗竭抑制埃博拉病毒感染。
为了研究Ca2 对培养细胞的EBOV感染的影响，我们测量了含有荧光素酶基因报告基因的EBOV假型病毒在细胞外和细胞内环境中调节Ca2 的感染力。 首先，在进入步骤中，细胞被埃博拉GP假型病毒感染，细胞内或外都存在Ca2 。 在存在外部Ca2 的情况下，埃博拉GP假型病毒的感染力是在无Ca2 的培养基中的感染力的三倍（图1a）。
为了测量细胞内环境中Ca2 的影响，我们使用了1,2-双（2-氨基苯氧基）乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸四酯（BAPTA-AM），一种仅在细胞内有效的螯合剂。28 Vero E6细胞用50mu;M BAPTA-AM预处理，该浓度不会显著影响其生存能力。29埃博病毒感染与螯合钙离子时相比，在未改变的细胞内钙离子水平下大约高出12倍（图
1b）。有关原始RLU值与非感染控件的比较，请参见图S1。
D522和E540残基参与Ca2 依赖性感染。
已知Ca2 在一些其他包膜病毒的融合中发挥作用。 风疹病毒依赖于Ca2 使其融合环正确定向。 具体来说，Ca2 与位于E1内相邻融合环上的残基N88和D136协调。 以前，我们表明严重急性呼吸系统综合症冠状病毒（SARS-CoV）的病毒进入是Ca2 依赖性的，并且当存在螯合剂时FP不能诱导膜有序。 （图1e）。结合干扰细胞Ca2 的药物抑制埃博病毒感染的证据以及TPC2在埃博病毒进入中的意义，这些带负电荷的氨基酸的存在促使我们探索Ca2 是否以类似风疹病毒和SARS冠状病毒的方式通过与FP的直接相互作用在埃博拉病毒融合中起作用。
我们假设Ca2 可能与病毒FP附近带负电荷的氨基酸相互作用，从而影响融合所必需的构象变化。在丝状病毒科的三个属（Cuevavirus、Marburgvirus和Ebolavirus）中，FP两侧的带负电荷残基的存在是高度保守的（图5f）。在522和540位置的负电荷残基的存在是保守的，尽管在522位置的残基的确切身份在天冬氨酸和谷氨酸之间因属而异。在埃博拉维病毒属中，扎伊尔、雷斯顿、本迪布焦和泰林物种在522位置含有天冬氨酸，而苏丹物种则被谷氨酸占据。FP嵌入在一个环中，环使残基D522、E523、E540和E545彼此靠近（图1d、e）。为了研究这些保守的带负电残基的活性，我们采用定点突变的方法在这些位置产生了带有中性残基的假病毒。我们产生了氨基酸替代物D522A、E523A和E545A。由于在用于质粒扩增的细菌内重组，产生突变E540A的尝试失败；因为丙氨酸和甘氨酸对Ca2 具有相似的亲和力，因此对突变E540G进行了表征。FP两侧各有两个带负电荷的残基，这意味着可能存在冗余，其中一个突变可能仍允许Ca2 与剩余的相邻带负电荷残基协调。为了测试这种可能性，我们还产生了双突变体D522A/E523A。这些突变体并没有阻止GP与假型病毒颗粒结合（图S2）。在细胞感染性试验中，含有D522A的假型病毒表现出与野生型GP的假型病毒截然不同的行为，并且在没有细胞外Ca2 的情况下产生更高的感染性（图1c）。E523A显示出比野生型更低的总体传染性，但与野生型Ca2 依赖性行为相匹配，在细胞外Ca2 存在下显示出更高的传染性。 通过与非感染性阴性对照比较，双突变体D522A / E523A处于极低水平的感染性（图S3）。 D522A / E523A的行为与D522A相似，在没有细胞外Ca2 的情况下具有更高的感染力。 这表明D522在埃博拉病毒对Ca2 的反应中起着核心作用，而E523可能对D522没有多余的作用。 E540G具有低感染性，并且相对不受细胞外Ca2 的影响。E545A具有与野生型相似的总体感染和Ca2 依赖性行为，表明它在与Ca2 相互作用中可能并不关键。 在测试的突变中，与野生型相比，D522A，D522A / E523A和E540G表现出改变的Ca2 依赖性或无依赖性。 给定这些残基的位置邻近FP，我们认为带有突变GP的颗粒的改变的进入行为可能与融合有关。 细胞外和细胞内Ca2 可能会改变细胞过程，而不仅仅是直接影响病毒的进入，因此在解释仅基于细胞的实验结果时很难将这些作用脱钩。 因此，我们接下来采用生物物理方法通过检查结构和融合活性来分离并进一步研究Ca2 的作用，而不会同时发生细胞途径的其他并发症。
Ca2 可增加EBOV融合体外。为了进一步定义Ca2 的作用并分离其对膜融合的影响，我们采用了报告脂质混合的囊泡融合测定法。我们使用了含有GP残基501-560的大肠杆菌表达的EBOV FP构建体（图2a）。与包含残基524-539的“短版” FP相比，这种“长” FP包含二硫键环，即对FP的结构和功能至关重要。在脂质混合实验中，将FP构建体与大的单层囊泡（LUV）混合，其中10％用FRET对进行了荧光标记。 LUV用于匹配假病毒颗粒的直径。这些标记的囊泡与未标记的囊泡融合后，FRET得以缓解，导致荧光强度大大增加（图2b）。将FP添加到混合物中后，添加洗涤剂以使LUV破裂并使染料完全释放。将所得的荧光强度设置为100％，以标准化从一个试验到下一个试验的数据。
在含有2 mM Ca2 的pH 5融合缓冲液中，与典型细胞培养基配方中发现的离子钙浓度接近，并且与先前文献中使用的浓度范围（0-2 mM）相同，观察到大约70%的脂质混合（图2b、c）。在不添加Ca2 的融合缓冲液中，以及在1mm EGTA存在下螯合微量Ca2 （“无钙缓冲液”）时，脂质混合比大大降低（39%）。作为阴性对照，在5 mM DTT存在下，即使加入2 mM Ca2 也能消除FP的二硫键，脂质混合大大减少（21%）。与FP残基相同但顺序混乱的扰肽具有更低的脂质混合活性（12%）。综上所述，这些数据表明Ca2 与FP相互作用促进融合。使用假病毒进行这些相同的脂质混合研究产生的脂质混合水平与DTT对照组相当，即使在低pH和钙的存在下，这表明受体NPC1或某些其他融合触发器对于由全病毒颗粒介导的脂质混合（图S9）是必需的。
我们生产了修饰的FP构建体，以匹配基于细胞的测定中使用的突变。 在存在Ca2 的情况下，野生型FP始终产生高水平的脂质混合，而当去除Ca2 时，混合的比例仅为混合的一半（图2c）。 不论是否存在Ca2 ，带有D522A突变的FP都能产生大约50％的脂质混合（图2d）。 在传染性研究中（图1c），该突变体确实表现出与野生型不同的行为，但在细胞外Ca2 存在下产生的感染较少。 与野生型相比，突变E523A导致脂质混合的适度降低，但当存在Ca2 而不是不存在Ca2 时仍引起更多融合（图2d），这与我们的细胞感染性观察一致。E540G是融合能力最低的，与我们的传染性研究一致，在E540G中，它也是测试的传染性最低的突变体，并且相对不受Ca2 的影响。 E545A产生的脂质混合水平也很低，并且不受Ca2 添加的影响。 这与我们的感染性实验不同，在该实验中，Ca2 确实增强了突变E545A对假型病毒的感染。 考虑到这些修饰的FP不再表现出强烈的Ca2 依赖性，我们的数据表明，位置522、540和545上带负电荷的残基对于与Ca2 配位很重要，并且除去这些带负电荷的氨基酸不利于融合。
Ca2 会增加EBOV FP膜的插入和脂质排列。 我们的融合测定实验表明，钙靶向融合肽，进而影响膜融合。 由于融合肽在融合过程中会插入宿主膜中，因此我们接下来将重点探讨使用电子自旋共振（ESR）检查钙对此插入的影响。 在该技术中，自旋标记在不同位置掺入脂质中，用作深度探针。 含有二棕榈酰磷脂酰-速度胆碱（DPPTC）的多层囊泡（MLV）在头部区域被自旋标记，而具有磷脂胆碱的多层囊泡被标记在上尾巴区域（5PC）或下尾巴区域（14PC）（图S4）。使用具有微观有序-宏观显微镜失调（MOMD）模型的NSSL程序，从ESR光谱中提取了每个自旋标记脂质的有序参数S0。 S0表示给定深度的膜有序量，并用作FP膜渗透深度的读数。更重要的是，FP诱导的S0变化被认为在功能上很重要，因为脂质有序的变化可以降低两者之间的能垒。 通过脱水紧密接近膜，从而使融合发生。 先前对其他病毒FP的ESR研究表明，病毒FP的膜排序是病毒膜融合的关键步骤.S0的S形曲线随野生型肽与脂质（P / L）比的增加而变化（图3aminus; c）建议在膜排序方面具有协同性，这与I类和II类融合蛋白进行低聚以有效进行融合的要求一致。然后，我们使用1 mM Ca2 来测试钙的影响，以匹配与我们先前对SARS-CoV FP的研究相一致的条件。 在酸性pH值为1 mM Ca2 的条件下，野生型肽诱导了头和上尾巴区域的最大排序效应（图3a，b），而深疏水区域（14PC）几乎没有受到影响（图3c）。 混乱的肽对膜没有排序作用，表明排序作用是序列特异性的。 在无钙缓冲液中，野生型 FP几乎不引起脂质有序化，与我们的阴性对照相似，DTT去除了带有二硫键的FP，实际上没有脂质有序化作用（图3a-c）。
如果Ca2 对野生型肽的影响严格地是由于介导了FP中负电荷和负脂质之间的静电排斥作用，那么我们可以预期，当FP与DTT混合时，由于氨基酸的电荷没有改变，FP仍然能够诱导有序化。DTT对肽诱导的脂质排序不利的观察表明，Ca2 并不像其他工作中所建议的那样，只是通过筛选电荷促进肽插入。39为了进一步测试Ca2 对S0的影响，我们增加了Ca2 浓度，同时将P/L比固定在1%（图3d，e）。当所有三种成分（脂质体，肽和Ca2 ）都从S0的测量值中减去脂质体和仅Ca2 （无肽）混合物的S0时，就消除了由Ca2 与脂质体而不是融合肽相互作用引起的任何有序影响。 存在，产生Delta;S0。 该Delta;S0随着Ca2 的增加而增加，表明在脂质头（图3d）和中尾部（图3e）区域中，较高的Ca2 浓度下，FP诱导的膜排列更多。 我们先前对流感HA的观察（在Ca2 存在下并未显示出膜相互作用增加）表明，Ca2 不能作为病毒FP插入靶膜的覆盖启动子。突变肽的ESR测定均显示随着P/L比的增加脂质有序化，但低于野生型肽（图S6）。在无钙缓冲液中，所有肽的排序效果都很小。增加Ca2 增加了FP诱导的头
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