环境肽-原卟啉IX双载脂质体体外抗HIV-1进入细胞的证据外文翻译资料

 2022-08-09 04:08

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环境肽-原卟啉IX双载脂质体体外抗HIV-1进入细胞的证据

摘要：我们开发了一种由大的单层囊泡(LUV)组成的纳米载体，用于联合输送两种人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)进入抑制剂恩呋韦肽(ENF)和原卟啉IX(PPIX)。ENF和PPIX分别是一种融合抑制剂和一种附着抑制剂，其固有的亲脂性导致它们自发地掺入到LuVS纳米载体的脂质双层中。这两种进入抑制剂都显著地分配给由1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3phosphocholine(POPC)和9：1的POPC:1，2dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene乙二醇(DPPEPEG2000)混合物组成的LUV，这两种混合物分别代表常规和免疫逃逸给药制剂。它们共同分布在脂质膜的核心。双负载纳米载体是单分散的，并且保持了未负载形式的尺寸分布、热致行为和表面电荷。与游离形式的组合相比，纳米载体中的两种进入抑制剂的组合在使用免疫逃逸制剂时表现出更强的抗HIV-1进入的协同作用。我们认为，当进入抑制剂装载到纳米载体中时，其改善的作用是由于它们在病毒进入部位缓慢释放所致。总体而言，脂质体在很大程度上仍然是病毒进入抑制剂组合的未被探索的平台，具有改善当前抗逆转录病毒治疗药物安全性和应用的潜力。我们的工作要求重新评估进入抑制剂组合的潜力，并将其用于临床抗逆转录病毒治疗。

关键词：HIV，进入，抑制剂，脂质体，膜，纳米载体，释放

人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)进入宿主免疫细胞是病毒包膜糖蛋白(Env)、细胞受体和辅助受体以及脂质膜之间复杂相互作用的结果。Env是这一过程中的关键分子，由gp120(外周)和gp41(跨膜)蛋白同源三聚体组成的异源二聚体，非共价结合在高度糖基化的亚稳态复合物中。这两个亚基都参与了多步进入过程，但具有独立的功能；

进入抑制剂是临床上用于对抗HIV-1的抗逆转录病毒药物之一，在病毒进入细胞之前针对感染的早期阶段。其机制可能在于通过抑制受体或辅助受体对接，或阻断膜融合所需的构象转变，防止病毒粒子有效地附着在细胞上。新的进入抑制剂候选药物在临床试验中经常失败，由于相关费用高，不希望的副作用，和次优的药动学性能，即低溶解度，半衰期较短。新的进入抑制剂药物候选药物在临床试验中经常失败，由于相关费用高，不希望的副作用，和次优的药动学性能，即低溶解度，半衰期短。

原则上，进入抑制剂的药代动力学和安全性将受益于使用软物质纳米载体装置的替代药物输送和靶向策略。最近，脂质体已被建议作为HIV-1抗逆转录病毒纳米载体的潜在支架，特别是用于进入抑制剂的输送。目前的脂质体技术已经实现了高度稳定的制剂，如免疫规避脂质体，能够有效地通过血液和淋巴循环输送，同时避免广泛的免疫系统介导的消除。脂质可以进行微调和化学修饰，以提供兼容的设计功能。通过这一点，脂质体可以改善多种药物的疗效和安全性，降低清除率、非靶向效应和毒性。因此，许多基于脂质体的制剂已获得临床使用批准，尽管很少有成功设计用于抗HIV-1治疗的制剂。尽管脂质体有潜力作为抗逆转录病毒药物组合的载体，但在抗逆转录病毒传递和协同作用方面，这些制剂在很大程度上仍未被探索。

几种Env靶向进入抑制剂对脂膜具有共同的高亲和力。进入抑制剂-脂膜的相互作用在文献中有很好的描述，并且与进入抑制剂的有效性相关。融合抑制肽(Enf)23和原卟啉IX(Ppix)，一种靶向envV3环-cd4结合的小分子，以它们与两性离子脂膜的广泛相互作用而闻名。为了利用这一特性，我们选择将其并入脂质体膜内，而不是普通的包埋策略，如所描述的抗癌策略。此外，与膜吸附和分配相关的enfalpha;-螺旋界面疏水性也是gp41结合的决定因素，受两种环境中肽二级结构含量的调节。应用免疫规避脂质体组合物，暴露来自PEG衍生脂质体的亲水性涂层，作为传统裸脂质体的替代方案，发现了进一步的优势。传统脂质体容易受到蛋白质调离和随后的系统消除的影响，而免疫规避聚乙二醇包衣脂质体。重点是双重给药和协同抑制HIV-1进入。考虑到ENF被批准用于抗逆转录病毒治疗，PPIX在临床上有多种应用，我们建议的纳米载体代表了一个有希望的概念证明，以改善治疗进入抑制剂的药物输送。

结果和讨论

ENF和PPIX对HIV-1进入具有协同作用。

在抗逆转录病毒治疗方案中使用的药物组合的有效性取决于有利的药物minus;药物相互作用，即协同作用。ENF靶向gp41预融合构象，并防止病毒融合孔形成所需的构象转变。另一方面，已知ppix与与cd4识别相关的gp120结构域结合，但其作用模式尚未完全了解。例如，ppix光动力学特性与增加的hiv-1失活无关。为此，我们通过改变体外加入进入抑制剂的时间(图S2和1，A)，研究了在病毒进入过程的不同时刻，每种进入抑制剂对HIV-1实验室适应株NL4TZM-minus;3(minus;-1NL4)进入TZM-BL细胞的效果(图S2和1，A)。两种进入抑制剂在预先孵育或与HIV1NL4minus;3同时加入细胞时效果最好。与同时加入minus;-1NL4或PPIX病毒预孵育1h相比，预先孵育HIV1NL4PIX3病毒并不能改善病毒灭活效果。病毒加入后1h或以后加入ENF，作用逐渐减弱，感染后3h加入ENF则完全无效。在感染后1h或之后加入PPIX完全无效，如用附着抑制剂硫酸葡聚糖(DEX)观察。我们的结果与PPIX作用于最初的Env gp120-CD4识别是一致的，而ENF则阻止了随后发生的gp41介导的融合。PPIX的抗逆转录病毒特性并不依赖于光激活，这在以前的研究中是建议的。这对我们的脂质体纳米载体系统是有利的，因为卟啉的光激活已知会破坏脂质双层结构。PPIX应用，以及金属衍生物，也有可能用于病毒共感染治疗，因为它们显示出对抗登革热、黄热病和水泡性口炎病毒的抗病毒特性，并具有互补的作用模式。

由于病毒附着和融合是HIV进入机制的连续步骤，与不同的靶糖蛋白相关，我们进一步测试了ENF和PPIX在水溶液中联合使用时是否具有抗HIV1NL4PPIX3进入的协同活性。因此，我们将每种进入抑制剂的效果分别与ENF：PPIX(1：25)组合的效果进行比较，同时将病毒加入体外细胞(图1，B)。平行评估在每种进入抑制剂和组合存在的情况下的细胞培养活性。进入抑制剂组合使ENF的IC50值从65.8nM降至21.3nM，PPIX的IC50值从987.8 nM降至531.4 nM(表1)。在相同的检测条件下，ENF和PPIX无细胞毒性(图S3)。为了了解观察到的效果是否是协同作用的结果，我们对组合剂量的minus;反应数据进行了联合比较和定量分析(图S4)。比较分析参考了Bliss独立性模型和Loewe加性模型。这些模型利用每个进入抑制剂的单独表现来预测其组合的相加效果，而与任何协同效应无关。由于它们的假设不同，这些模型提供了与实验数据比较的补充阈值，以便评估协同效应(支持信息，第1节)。ENF：PPIX组合的中效曲线与Bliss独立模型重叠，与Loewe相加模型相比，在高浓度时表现出相对正的拐点，表明低-中度协同作用(图S4，A)。由于Enf和Ppix都作用于Env复合体，在病毒进入的水平上，预计它们的联合作用不会超过预期的Bliss效应。通过Chouminus;Talalay定量方法测定的结合指数(CI)值也表明，当IC50值高于IC50时，进入抑制剂具有协同作用，CI值低于1(图S4，B)。在这两个分析中，协同作用是剂量依赖性的，也就是说，在进入抑制剂浓度诱导更强的抑制时，协同作用是明显的。

根据文献，与PPIX相比，ENF分别与CCR5和CXCR4拮抗剂进入抑制剂马拉韦罗(Maraviroc，MVC)和AMD3100显示出更高的协同作用，尽管这两种化合物都抑制HIV-1的进入，但MVC和AMD3100都不作用于病毒环境复合体。它们与内源性细胞辅助受体结合，这可能是与PPIX的协同潜力明显不同的原因之一。尽管如此，PPIX可以广泛地影响HIV-1CD4的附着，而不依赖于病毒的共受体趋向性，而MVC和AMD3100的应用分别针对R5或X4病毒，在系统感染的独立阶段。考虑各个进入抑制剂之间的分子比例组合所产生的潜在差异也是相关的。

ENF和PPIX在脂质体中向脂质双层核心的分配。

我们质疑磷脂酰肌醇(1palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)是否也会有类似的行为，从而确立了磷脂酰胆碱(POPC)作为一种可能的脂质支架的可能性，从而实现了脑源性神经营养因子和磷脂酰肌醇的双重负载。使用两种进入抑制剂的本征荧光发射，我们监测了对POPC luvs膜的分配(图2、A和B)。此外，还研究了一种由9：1的POPC和1，2-dipalmitoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene乙二醇组成的免疫逃避配方(DPPEPEG2000)。PPIX显示出对POPC和POPC：DPPEG2000LUV膜的相当大的分配，如各自的分配常数(Kp)值3.07times;103和3.98times;103(表2)所示。ENF也向两种脂质成分的LuVS膜分配，Kp值分别为1.18times;103和0.92times;103(表2)。根据进入抑制剂的时间分辨荧光发射曲线，加入LuV后，ENF和PPIX在10分钟内都达到分配平衡(图S5)。与每个进入抑制剂相关的Kp值的高数量级表明，分配平衡将实质上朝着膜结合和积累的方向移动。聚乙二醇包衣脂质体已经被认为是脂溶性卟啉的合适载体，因为它们似乎被聚合物包衣稳定。即使聚乙二醇网状包衣阻止蛋白质粘附到膜表面，它仍然允许小分子和肽的渗透。由于系统依赖于进入抑制剂向脂膜的分配来有效负载，它还依赖于环境因素对作用部位从膜释放的分配平衡的影响，例如由于进入抑制剂掺入细胞膜或脂质体内化或降解引起的平衡移动。由于这些化合物聚集在脂质体脂质双层的外层小叶中，即使在脂质体与细胞质膜融合的情况下，它们也会释放到细胞外空间，在其作用部位附近变得可生物利用。

虽然这两种进入抑制剂都向被研究的LuV分配，但它们可能会竞争膜上的负载空间，从而降低进入抑制剂LUV(EI-LUV)纳米载体系统的转运效率。我们通过微分进入抑制剂荧光发射猝灭的方法，探讨了进入抑制剂在子宫内膜POPC和POPC：DPPEG2000脂质双层中的渗透深度。分别位于双层界面和中心区域的亲油淬灭剂5-十二烷基硬脂酸(5-NS)和16-十二烷基硬脂酸(16-NS)被用来估计各自的进入抑制剂的膜内深度定位(图2，C和D；图S6)。ENF色氨酸残基(Trp)位于离POPC和POPC：DPPE-PEG2000LUV中双层中心12.8和9.6micro;处的更靠近双层界面的位置，这是其他gp120衍生的融合抑制肽所遵循的趋势，并与文献中以前的报道一致。由于ENF TRP更靠近C末端，因此肽可能像预测的其他膜活性肽一样呈现轻微倾斜的插入位置。46PPIX被预测埋藏在膜内，分别距离POPC和POPC的双层中心约4.8和4.0ordm;：DPPE-PEG2000LUV。在这种情况下，不能检测到5-NS淬灭剂的淬灭(图S6)。PPIX有望在高度疏水的环境中完全插入，使其羧基朝向脂极性头部。因此，ENF和PPIX插入到脂质双层中，但重叠很小，因此有可能独立于PEG涂层而同时装载到LuV中。

为了评估两种进入抑制剂是否真的可以同时加载到LUV中，我们使用基于Fo共振能量转移(FRET)的荧光光谱方法监测了EnF和PPIX在膜内的共定位(图2，E)。FRET效率与供体和受体荧光团的接近程度有关。在水溶液中，进入抑制剂之间的FRET效率为0.17，我们将其指定为PPIX聚集的基础水平，促进了供体和受体荧光团之间的接触。当与POPC或POPC：DPPE-PEG2000LUV孵育时，FRET效率分别提高到0.49和0.41。FRET效率的这种增加表明ENF和PPIX之间的距离由于朝着相同的膜共分配而减小。这进一步支持了用于进入抑制剂双负荷和各自的抗逆转录病毒应用的常规和免疫逃避LuV配方的兼容性。

EI-LUV纳米载体在溶液中是稳定的。

脂质体在纳米载体药物输送应用中的药代动力学优势依赖于胶体稳定性，特别是如果治疗分子负载在膜水平，这就是本研究的情况。大多数临床批准的脂质体配方的直径在50到300纳米之间。根据对脂相的亲和力和各自的化学成分，小分子和多肽可能会诱导luv聚集、脂质混合和/或破坏，这对于药物输送应用是不可取的。luv的平均流体动力学直径(DH)、多分散指数(Pdi)和zeta;电位被量化，这在药物输送应用中是不可取的。我们选择了适合于体内应用的popc luv，它们避开了单核巨噬细胞系统，最大限度地增加了进入抑制剂的分隔度。根据对脂质体的亲和力和各自的化学成分，小分子和多肽可能会诱导luv聚集、脂质混合和/或破坏，这对于药物输送应用是不可取的。(Dls)，并用作稳定性度量(图3，Aminus;C；图S7)。未负载的POPC和POPC：DPPE-PEG2000(9：1)的sim;分别为单分散(PDIPEG0.1)和两性离子，其DH分别在110~130 nm之间。两种进入抑制剂在与体外实验相关的浓度下与Luv结合，产生单负载或双负载EI-LUV纳米载体。将ENF单次加载到LuVS膜中并不显著改变其大小和电荷的生物物理性质(图S7)。相反，在PPIX单次加载时，两种脂质成分的LuV显示DH略有增加，但对强度平均尺寸分布没有显著影响(图S6)。这被PPIX负载的EI-LUV的PDI值的增加和zeta;电位的降低所补充。免疫逃避狼疮细胞的聚乙二醇涂层可阻止zeta;电位的下降。当两种进入抑制剂联合在LUV中时，它们的生物物理性质，如大小和电荷，主要受到PPIX的影响，正如对每个进入抑制剂的独立实验所预期的那样(图3，Aminus;C)。在所有情况下，LUVS的PDI值都维持在0.3以下，这是单分散系统可接受的值。有必要承认，即使在相关的抑制浓度下，进入抑制剂也不会破坏LUVS膜的完整性。重要的是，系统稳定性似乎依赖于

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