镉胁迫下大豆根瘤和根系抗氧化防御系统的响应外文翻译资料

 2022-08-15 03:08

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附录A：外文译文

镉胁迫下大豆根瘤和根系抗氧化防御系统的响应

卡丽娜·B·巴莱斯特拉斯、卢卡·嘉迪、苏珊娜·M·加莱戈、玛丽亚·L·托马罗

阿根廷布宜诺斯艾利斯大学法马西亚比奥库米卡生物学院，邮编956（1113）布宜诺斯艾利斯。相关作者；电子邮件：ptomaro@ffyb.uba.ar

摘要

在CdCl2的3种不同浓度( 50、100和200 micro;M )下，研究大豆根瘤和根的抗氧化防御体系。镉( Cd )诱导的氧化应激是通过脂质过氧化来确定的，在50K00M Cd (Ⅱ)处理的结节和根中仍未改变。100个micro;M Cd (Ⅱ)处理的结节无变化，而根中增加了20 %，200个micro;M Cd (Ⅱ)在两种组织中都产生了约55 %的增加。可溶性抗氧化防御、还原型谷胱甘肽( GSH )和相应的还原型/氧化型谷胱甘肽( GSH / GSSG )比值在两种组织中均表现出不同的行为，在100和200 micro;M Cd (Ⅱ)的根中表现出下降的趋势。3种Cd处理下根瘤中GSH / GSSG比值无变化。但3种Cd浓度下，根瘤和根中抗坏血酸含量和抗坏血酸/脱氢抗坏血酸( As / DAs )比值均降低。在抗氧化酶方面，发现除过氧化氢酶外，仅在200K00M Cd (Ⅱ)处理下，结核酶活性普遍下降。尽管如此，在较低Cd处理下，根酶抗氧化防御体系的L-抗坏血酸过氧化物酶( APOX )、脱氢抗坏血酸还原酶( DHAR )和谷胱甘肽还原酶( GR )活性显著增加，而酶活性则随着两种较高浓度CdCl2而降低。这些结果说明，尽管Cd浓度越高，大豆根系对两种组织抗氧化防御系统均产生氧化应激和有害作用，但Cd处理对大豆根系的影响大于根瘤。

关键词：抗氧化防御系统、镉、大豆、氧化应激

引言

农业上氮 ( N ) 固定最主要的形式是根瘤内根瘤菌——豆科植物共生进行的。这种固定的氮大部分用作作物植株的肥料。然而，热、干旱、盐度、营养盐缺乏和重金属等不同类型的环境胁迫显示出对豆科植物根瘤形成和功能的影响( Porter和Sheridan 1981，Casella等1988，Delgado等1994，de Lorenzo等1994，Gogorcena等1995，1997，Fernaacute;ndez-Pascual等1996，Comba等1997，1998 )。这些环境压力中的许多都应该产生氧化应激。尽管有关大豆根瘤在盐或干旱胁迫下抗氧化防御系统的变化规律的报道较多，但对该系统中重金属诱导的氧化损伤却知之甚少。大豆是世界上重要的作物，提供优质的蛋白质，增加结合氮进入土壤的输入。但其产量可能受到不同环境胁迫的不利影响。影响植物生产力的主要非生物胁迫之一是工业和城市活动、污泥和农用化学物质造成的重金属过量进入土壤。镉是主要的工业污染物之一，即使低剂量也表现出药害( Somashekaraiah et al . 1992，Das et al . 1997 )。Cd在植物体内的确切作用表现为萎黄( Das et al . 1997 )、生长抑制( Ouariti et al . 1997 )、氧化损伤( Gallego et al . 1996，1999 )和脂质过氧化( Hendry et al . 1992 )。固氮生物以及整个植物都发展了一个复杂的抗氧化系统，包括GSH、抗坏血酸、alpha;-生育酚、类胡萝卜素和保护植物免受氧化损伤的酶( Salin 1991，Dalton 1995 )。GSH是一种二硫化物还原剂，它能够保护酶的巯基、再生抗坏血酸，并能与单线态氧、过氧化氢、羟自由基反应，在保护植物免受重金属导致的的活性氧( Kunert and Foyer1994 )中起着核心作用。抗坏血酸( As )是光合生物中另一种普遍存在的可溶性抗氧化剂，也是植物细胞中重要的可溶性抗氧化化合物( Nakano和Asada1981，Luwe等1993，Borraccino等1994 )，也是H2O2解毒最重要的还原底物。超氧化物歧化酶( SOD )是一组加速O2 -向H2O2转化的酶( Salin1987 )。过氧化氢酶( CAT )、APOX以及多种通用过氧化物酶催化H2O2分解。在抗坏血酸-戊二烯循环中，APOX的酶促作用产生单脱氢抗坏血酸自由基，可自发地向As和脱氢抗坏血酸( Das )转移或被NADPH依赖的单脱氢抗坏血酸还原酶( MDHAR )酶促还原为As。还有，DAs在GSH依赖的脱氢抗坏血酸还原酶( DHAR )介导的反应中被酶促还原为抗坏血酸。由此产生的GSSG随后被NADPH依赖的GR ( Dalton 1995 )转化回GSH。铜( Cu )、铁( Fe )等几种金属引起的氧化损伤可直接解释为涉及氧化还原状态的变化( Fenton反应)。Cd毒性的分子机制尚不清楚( Stohs和Bagchi 1995 )。为了揭示Cd暴露造成的毒性，我们对不同Cd浓度下大豆根瘤和根中抗氧化防御系统的变化以及氧化应激的产生进行了研究。

材料与方法：

化学试剂：

NADPH、GSH、GSSG、5，5′-二硫代双( 2 -硝基苯甲酸) ( DTNB )、GR、硝基蓝四唑( NBT )、2 -乙烯基吡啶均来自Sigma化学公司( St Louis，MO，美国)。其他化学物质均为分析级别。

植物材料与生长条件：

大豆种子用5 % v / v次氯酸钠表面消毒10 min后用蒸馏水洗涤数次。种子接种日本黄根草108细胞mL-1 ( 109，INTA Castellar )，在蛭石中种植5 d。发芽植株从盆中取出后，仔细洗净根系，轻轻转移到分离的容器中进行水培。植物在24plusmn;2℃、相对湿度50 %的控制气候室内萌发生长，光周期16 h，光照强度175 micro; mol M-2s-1 (由飞利浦的3盏TL40 W / 34灯和奥斯拉姆的1盏L36 / W77FLa灯提供)。水培培养基为Hoagland的营养液( Hoagland and Arnon 1953 )。培养基不断加气，每3 d更换一次。4周后用不含Cd (对照)或含50、100和200 micro;M 的CdCl2的营养液处理植株。处理48 h后分离根和根瘤，用于测定。每个试验重复3次，共5个重复。

硫代巴比妥酸反应物质( TBARS )测定：

脂质过氧化反应用TBA反应中测定的TBARS的量衡量（根据Heat和Packer 1968）。脂质过氧化测定采用Heath ( 1968 )描述的硫代巴比妥酸( TBA )反应测定的硫代巴比妥酸反应物质( TBARS )量。取新鲜对照和处理过的结节和根( 0.3 g )置于3 m L的20 % ( w / v )三氯乙酸( TCA )中匀浆。匀浆3500g离心20min。取上清液1 m L，加入含0.5 % ( w / v ) TBA和100 micro; L 4 %丁基羟基甲苯( BHT )的20 % TCA中的1份。混合物在95℃下加热30min，然后在冰上迅速冷却。在1000转离心15min后，测定吸光度532nm。减去600 nm处非特异性吸收值。TBARS浓度采用1.55 mM-1 cm-1的消光系数计算。

谷胱甘肽测定法：

将0.3 g结节或根匀浆于3 mL 0.1 HCl ( pH 2 )、1 g聚乙烯吡咯烷酮( PVP )中提取非蛋白巯基( Schupp和Rennenberg 1988 )。离心10000转，4℃离心10min后，取上清液进行分析。匀浆中总谷胱甘肽含量( GSH加GSSG )采用酵母- GR、DTNB和NADPH在412nm处分光光度法测定。GSSG在2 -乙烯基吡啶存在下用同样方法测定，GSH含量由总谷胱甘肽含量与GSSG含量的差值计算( Anderson 1985 )。

抗坏血酸和脱氢抗坏血酸测定：

As和DAs的测定如Law等描述。取1克组织匀浆于10 % ( w / v ) TCA中，上清液用于检测。对于使用的浓度，一半供试品测定总抗坏血酸含量，另一半只测定As，再由差异推导DAs浓度。取提取液400K00L加入氢氧化钠( 10K00L，5M )，混匀，3500g离心2min。取上清液200 - micro; L，加入150 mm Na H2PO4缓冲液200 micro; L，p H 7.4，水200 micro; L。另取200 micro; L上清液，加入200 micro; L缓冲液和100 micro; L 10 - mM二硫苏糖醇，充分混合后室温静置15 min，加入100 micro; L 0.5 % ( w / v ) N-乙基马来酰亚胺。两种样品均为涡旋混合，室温孵育30 s。各加入10 % ( w / v ) TCA的400 micro;L，44 % ( v / v ) H3PO4的400 micro;L，4 % ( w / v )联吡啶在70 % ( v / v )乙醇中的400 micro;L，3 % ( w / v ) FeCl3的200 micro;L。涡旋混匀后，37℃温育60 min，记录525时的吸光度。采用As或DAs的标准曲线进行标定。

豆血红蛋白:

取0.3 g根瘤于含0.02 % ( w / v )铁氰化钾( K )和0.1 %碳酸氢钠的提取培养基3 m L中匀浆。采用LaRue和Child ( 1979 )所述的荧光法，在匀浆离心后得到的红色上清液(根瘤细胞匀浆)中估算血红素( Lb )。以牛血红蛋白为标准。

固氮测定：

固氮测定采用乙炔还原活性测定法( Hardy等1968 )。根瘤包围在100 mL瓶中，用空气中含C2H2 ( 10 %，v / v )的橡胶塞子密封。60 min后取0.5 m L气体样品，用配备氢火焰离子化检测器的Konik 3000 HRGC色谱仪( Hewlett Packard熔融石英毛细管HP-plot Al2O3柱，烘箱温度120℃，载气：N2，流速30 m L min-1 )分析乙烯。

酶制剂和检测方法：

取0.3 g根瘤或根在冰冷条件下均质的提取液3 m L，含50 mm磷酸盐缓冲液( p H 7.4 )、1 mm EDTA、1 g PVP、0.5 % Triton X-100，4℃下浸提，制备CAT、SOD、APOX、GPOX活性测定提取物。匀浆离心1000g，离心20min，上清液用于检测。在含50 mm磷酸钾缓冲液( p H 7.2 )和2 mm H2O2的反应介质中，测定过氧化氢酶( CAT )在匀浆中的活性，在240 nm处的吸收度下降。测定H2O2吸收减少的伪一级反应常数( k acute; = k . [ CAT ] )，用k = 4.7times;107M-1s-1计算pmol mg-1蛋白中过氧化氢酶含量( Chance et al . 1979 )。总SOD活性通过抑制NBT的光化学还原来测定，如Becana等[ 9 ]描述。( 1986 )。反应混合物由50 ~ 150 micro; L酶提取液和3.5 m L O2生成液组成，其中蛋氨酸14.3 mm，NBT 82.5 micro; m，核黄素2.2 micro; M。提取液加入50 mm K磷酸盐( p H 7.8 )和0.1 mm Na2EDTA，定容至0.3 m L。摇动试管，置于距灯库30 cm处，由6盏15 W荧光灯组成。反应允许运行10min，通过关灯停止。NBT还原后在560nm处读取吸光度。空白和对照分别以相同的方式运行，但不加光照和酶。SOD的一个单位定义为在试验条件下产生50 %抑制NBT还原的酶量( Giannopolitis and Ries 1977 )。在新鲜提取物中立即测定APOX活性，采用Nakano和Asada ( 1981 )描述的反应混合物( 1 m L )，其中K-磷酸盐缓冲液( p H 7.0 ) 50 mm，H2O2 0.1 mm，As 0.5 mm，EDTA 0.1 mm。通过测定提取液、50 mm K-磷酸盐缓冲液p H 7、0.1 mm EDTA、10 mm愈创木酚和10 mm H2O2反应中四愈创木酚( ε：26.6 mm ~ 1 cm-1 )在470 nm处吸收的增加，测定匀浆中GPOX活性。取0.3 g结瘤或根在冰冷条件下匀浆，用含50 mm Tris-HCl缓冲液( p H 7.6 )和1 mm EDTA的萃取缓冲液3 m L制备GR和DHAR活性测定提取物。GR活性通过跟踪NADPH氧化后在340 nm处吸光度的下降来测定。反应混合物包括组织提取液、1 mm EDTA、0.5 mm GSSG、0.15 mm NADPH和50 mm Tris-HCl缓冲液( p H 7.5 )和3 mm Mg Cl2 ( Schaedle和Bassham 1977 )。DHAR活性测定采用Nakano和Asada ( 1981 )所述，在含有2.5 mm GSH、0.1 mm EDTA、0.2 mm脱氢抗坏血酸和50 mm K-磷酸盐缓冲液( pH 7.0 )的反应混合物中，在265

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