四倍体青蒿毛状根比二倍体青蒿毛状根产生更多的青蒿素外文翻译资料

 2023-01-04 10:01

四倍体青蒿毛状根比二倍体青蒿毛状根产生更多的青蒿素

原文作者 ：JL De， PJ Weathers

单位：Worcester Polytechnic Institute

摘要：二倍体青蒿（克隆YUT16）的毛根培养物生长迅速并能产生抗疟倍半萜青蒿素。 但是我们对于多倍体如何影响转化毛状根的生长和次生代谢产物的生成知之甚少。因此我们利用秋水仙素，从YUT16毛状根克隆中产生了四个稳定的青蒿四倍体克隆。 与二倍体克隆相比，结果分析显示了毛状根生长和青蒿素生产的主要差异。 四倍体克隆产生的青蒿素比二倍体亲本的6倍还多。 本研究为增加我们对多倍体尤其是毛状根多倍体在次生代谢产物中的作用的了解提供了关键的一步。

关键词：疟疾；多倍体；转化毛状根

缩略词：AN：青蒿素；DW：干重；FW：鲜重；HPLC：高效液相色谱

绪论

在大多数植物物种中，人工多倍体增加了细胞的大小，产生了更大的生殖和营养器官（Adaniya et al. 2001; Chen et al.1979; Watrous et al.1988）。植物营养器官，例如根，是许多商业上重要的次级代谢产物的来源（Pal Bais et al. 2001）。托法烷生物碱，萜类化合物和异黄酮类化合物是从植物根部提取的重要的药用化合物。例如银杏叶的银杏内酯和印度草药毛喉鞘蕊花的毛喉素都是传统用于治疗心脏和呼吸系统疾病的药物，而这仅仅是许多具有药用功能的特异性根次级代谢产物的两个例子。

例如，四倍体洋甘菊，矮牵牛和丹参与它们二倍体亲本相比每克组织可产生更多的黄酮类化合物和萜类化合物（Gao et al.1996; Griesbach et al. 1996）。

青蒿可与许多其他萜类一起产生倍半萜抗疟药青蒿素（Meshnick et al.1991）。用发根农杆菌转化青蒿植物可形成产生高水平青蒿素的转化毛状根（Jaziri et al.1995;Weathers et al.1994）。因此，青蒿为研究人工多倍体在类萜生产中的作用提供了一个有用的模型系统。

此前，Wallaart等（1999）曾通过使用有丝分裂抑制剂秋水仙素诱导形成青蒿植物的多倍体，从18条染色体增至36条。在该研究中，比较了四倍体青蒿毛状根培养物与其二倍体亲本培养物的生长和青蒿素产量的差异。研究表明多倍体诱导效率为20％，每克干重四倍体青蒿平均特异性青蒿素水平（mu;g）比二倍体植高38％。然而，四倍体植物的生物量积累低于二倍体植物，因此每平方米植物的青蒿素净产量减少25％。尽管四倍体整株植物的总青蒿素产量较低，但该研究仍表明使用毛状根培养物来优化生长和青蒿素生产的可能性。

1材料与方法

1.1植物材料

使用由Weathers等人（1994）描述的青蒿YUT16克隆的转化根培养物。每两周通过将0.5 g鲜重的根传代培养到含有补充有3％蔗糖的50 ml pH5.7的Gamborgs B5培养基（Gamborg et al.1968）的125 ml锥形瓶中。保持在25℃，在连续冷白荧光灯（5 mu;Em -2 s -1）下100 rpm摇动培养。

1.2青蒿毛状根多倍体的诱导

将浓度为0，0.5％，0.25％，0.1％或0.05％（w/v）的过滤灭菌的（0.2 mm）秋水仙碱（Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo.）加入到水中经灭菌的培养基（Gamborgs B5 3％蔗糖，pH 5.7）。为了诱导多倍体，我们在未涂布的聚苯乙烯中放置来自14日龄培养物的单根2 cm长的根尖，每孔含有5 ml含秋水仙素的培养基的六孔板（Falcon no.351146），并在室温下孵育1-7天。在秋水仙碱处理后，将根尖用约10 ml新鲜B5培养基冲洗两次转移到新鲜的B5半固体培养基（0.2％w/v GelRite，Sigma-Aldrich）中，并在25℃在黑暗中孵育30天。为了确定存活率，每隔一天从秋水仙碱培养基中取出根部7天。随后的根系从始于秋水仙素处理的根部生长的任何侧根尖开始。这些新的根系每月检查倍性水平的稳定性。二倍体青蒿YUT16克隆以与秋水仙碱处理的根尖相同的方式生长，但不添加秋水仙素。

2制备用于倍性水平测定的染色体

在诱导多倍体之前，对青蒿的YUT16克隆进行细胞学检查以确定其二倍体染色体数目（2n=18）。将来自所有培养物的单毛根样品在饱和alpha;-溴萘溶液中于4℃预处理24小时以在中期积累细胞。然后将至少十个根在冷的Carnoys溶液（3：1，100％乙醇：冰醋酸）中固定过夜。用去离子水冲洗两次后，根尖在60℃的1 N HCl水解8 min，然后用去离子水冲洗。通过印迹除去过量的水，并将根在室温下在Feulgen溶液（Singh 1993）中染色2 h。将染色的根尖分生组织（约3 mm长）移出，置于干净的载玻片上，并用1％（w/v）乙酸胭脂红压碎（Singh 1993）。用放大1000倍的光学显微镜观察制剂。使用尼康Coolpix数码相机观察最佳中期视野。对每个克隆分析至少二十个分生组织。每个假定的四倍体克隆在40次传代培养中至少20次被证实为多倍体。

3生物量分析

在用去离子水洗涤根部并吸干后测量鲜重。在根部在60℃烘箱干燥至少24小时或直到体重不再波动后测量干重。

4青蒿素的提取与分析

青蒿素（AN）萃取，并根据由Smith等（1997）描述的方法进行了以下修改后在260 nm处高效液相色谱（HPLC）分析测定。鲜重标记的1 g根用3 ml闪烁分析的甲苯萃取两次在冰冷的水中超声波浴30分钟。将提取物以4390 g离心10分钟，然后倾析出上清液，合并，在氮气下干燥并储存于-20℃以备后用HPLC分析。

对于HPLC分析，首先将AN样品转化为它们的Q260衍生物（Smith et al.1997），然后将其应用于内径为4.6 mm，含有5 mm硅珠（10 nm孔径）的15 cm Microsorb-MV C-18柱（Varian，Walnut Creek，Calif）。流动相由0.01 M磷酸钠缓冲液：甲醇[55:45（v/v）] pH7.0以1.0 ml/min的流速组成。AN（Sigma-Aldrich）的线性校准曲线在0.1~0.5 mg/ml范围内测量。AN在这些条件下的保留时间约为12.0分钟。每个样品第二次与已知量的青蒿素共注射以验证峰识别。

5单根生长研究

将来自建立的二倍体（YUT16）和四倍体克隆（图1）的长2 cm的单根接种到六孔聚苯乙烯板（每孔一根）中，并如上所述对摇瓶中的培养物进行培养（Kim et al.2002; Srinivasan et al.1997）。记录根长、侧面数目和根部的一般外观。为了直接比较不同四倍体克隆的结果，我们通过用根尖数量缩放主根的总长度来计算每根根长度的分数增加情况（Yu et al.1994; Wyslouzil et al.2000）。这被定义为根生长单位（RGU），RGU=（所有侧枝的长度 主根长度）*（根尖数目）-1。

对于根直径测量，将来自14日龄摇瓶培养的单根固定在显微镜载玻片上，并使用光学显微镜40times;目镜与10times;物镜下测量其距根尖1 cm处的直径，每个克隆测量10次。

6统计分析

使用T检验和方差分析（ANOVA），分析来自所有实验的数据。所有实验至少有三到六次重复，每次实验至少进行两次操作。

7结果与讨论

7.1多倍体的确认和稳定性

YUT16亲本克隆的根尖的细胞学检查证实它是二倍体的，具有18个染色体（图1A），如之前由其他人（Wallaart et al.1999）确定的相同。在秋水仙素处理期间，无论使用秋水仙素的浓度如何，约有25％的根尖会死亡。幸存的秋水仙素处理的根长出新的侧根尖，用于创建随后的根系。这种方法总共产生了40多个根系。这些根被准备用于显微镜检查染色体，并且每个根尖至少有20个明确定义的中期显示被计数（图1）。由0.25％或0.5％（w/v）的秋水仙素浓度处理7天对于产生四倍体毛状根克隆是最有效的。该方法中使用秋水仙素的多倍体诱导效率低。在筛选的40个根系中，只有4株（YUT16-9Lb，YUT16-8LT，YUT16-6P和YUT16-7P；图1）被确定为n=36的稳定四倍体。由于研究的所有四种克隆在形态上彼此不可区分，因此仅显示了四倍体克隆YUT16-6P中的一种。四倍体及其二倍体亲本每月进行细胞学检查共18个月，以验证倍性稳定性（图1）。

图1：A-D根形态（从125ml烧瓶的底部看）和青蒿的二倍体和代表性四倍体克隆的染色体数目。A来自YUT16的细胞显示染色体的正常二倍体数目（2n = 18）。C来自四倍体YUT16-6P的细胞显示4n=36条染色体。 B、D为根形态：B为二倍体YUT16，D为四倍体YUT16-6P。Bar：10mm。

尽管在二倍体和四倍体克隆之间没有观察到明显的形态差异（图1，B-D），但一个克隆（未显示）YUT16-7LT产生非常厚的卷曲根。尽管增长缓慢，但与其他克隆所需的双周培养相比，YUT16-7LT需要每周更换培养基以维持生存能力。这种不寻常克隆的不良增长使得研究变得困难，因此不进行染色体分析（数据未显示）。

7.2二倍体和四倍体克隆的生长

为了比较四倍体克隆与其二倍体亲本的生长，我们在摇瓶六孔板中单独培养根。最初我们使用来自迟对数培养物（14天）的接种物来比较摇瓶中的生物量。表1显示，当培养物用以下物质引发时，所有四倍体克隆产生的生物量显着低于二倍体YUT16的生物量（FW，DW和％DW）。植物中多倍体的共同结果是生长和发育期间细胞分裂的数量减少（Adaniya et al.2001; Otto et al.2000），因此整体降低的生长速率并不令人惊讶。然而，以前用毛状根培养物进行的研究表明，接种培养物的年龄可能会影响根系生长以及次生代谢产物的生成（Takahashi et al.2001; Weathers et al.1996,1997）。由于高生长速率对于获得较高的整体次生代谢产物生产力以及特定产品产量同样重要，因此我们决定使用较迟的接种物（20天）以查看年龄是否对生物量的积累产生影响。当使用20天的接种物时，二倍体YUT16仍然比四倍体更好地生长（表1）。因此，接种年龄似乎不会改变四倍体的生长速率。尽管四倍体克隆都比二倍体积累了更少的生物量，但一个克隆YUT16-6P一直比其他三种四倍体生长得更好。事实上，这个克隆的增长率仅比二倍体YUT16的增长率低12~20％（表1）。

尽管在摇瓶实验中可以常规确定特定根克隆的总生物量和代谢产物，但测量单根的生长是困难的。理解液体环境中根系生长行为的更好方法是跟踪单个根的伸长和分枝（Kim et al.2002; Wyslouzil et al.2000）。这可以更详细地了解根系生长动力学（Yu et al..1994），形态变异可能与根系特征如生长速率和次生代谢产物水平等因素有关（Bhadra et al.1993）。已证明使用六孔板对于这样的研究是有用的（Kim et al.2002; Srinivasan et al.1997）。每个六孔板提供六次重复实验，只需最少量的培养基和空间，可提供大量信息（表2）。

我们比较单根生长的研究表明，所有四倍体克隆的根直径明显大于二倍体YUT-16（表2）。多倍体通常产生较大的植物器官（Otto et al.2000）。有趣的是，与二倍体YUT16相比，所有四倍体克隆的大部分其他特征的生长值都较低（表2）。然而，当四倍体相互比较时，克隆YUT16-9Lb产生侧根数和每厘米侧根数（即横向密度）最高。同样，克隆YUT16-6P具有最大的总长度和总根长（表2）。

表1用14或20日龄接种物起始培养物的青蒿二倍体和四倍体毛状根克隆生物量积累和青蒿素（AN）产量

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Biomass (g FW)

Biomass (g DW)

Percentage dry weight

Biomass ratio

AN

(mg/g DW)

AN

ratio

Total AN (mg/flask)

Total AN

Fourteen-day-old inoculumb

YUT16

3.1a

0.29a

9.4a

1.0

0.40a

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