通过VIGS技术对苦蘵药效成分合成途径的解析外文翻译资料

 2023-01-07 11:01:08

Vacuum and Co-cultivation Agroinfiltration of (Germinated) Seeds Results in Tobacco Rattle Virus (TRV) Mediated Whole-Plant Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) in Wheat and Maize

Ju Zhang1,2, Deshui Yu1,2, Yi Zhang1,2,3, Kun Liu1,2, Kedong Xu1,2, Fuli Zhang4,Jian Wang1,2, Guangxuan Tan1,2, Xianhui Nie1,2,4, Qiaohua Ji1,2,4, Lu Zhao1,2,4 andChengwei Li1,2,5*

1 Key Laboratory of Plant Genetics and Molecular Breeding, Zhoukou Normal University, Zhoukou, China, 2 Henan Key Laboratory of Crop Molecular Breeding and Bioreactor, Zhoukou, China, 3 College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou, China, 4 College of Life Science and Agronomy, Zhoukou Normal University, Zhoukou, China, 5 College of Life Science and Technology, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang, China

现今烟草脆裂病毒（TRV）介导的病毒诱导的基因沉默（VIGS）常用于双子叶植物。在这里，我们表明它也可以用于单子叶植物，通过提出一个涉及使用新型渗透溶液的系统（含有乙酰丁香酮，半胱氨酸和吐温20），作用在整个植物水平的VIGS（可发芽）小麦和玉米种子。使用已建立的系统，八氢番茄红素脱饱和酶（PDS）基因成功沉默，导致典型的光漂白处理过的小麦和玉米叶片的症状。另外，小麦MLO的等位基因，一个关键的基因抑制白粉的防御反应用这种系统在小麦中的霉菌同时在易感小麦中沉默，导致它变得对白粉病有抵抗力。该系统具有优势通常与TRV介导的VIGS系统相关（例如，高效、温和的病毒感染症状和不同器官的有效性）。但是，它也有进一步的优点：（可发芽）种子阶段农杆菌渗入；更快速和方便；全植物水平基因沉默；充分稳定的转型；适用于研究种子萌发和早期参与的基因功能植物发育阶段。

关键词：TRV-VIGS，真空和共培养农杆菌渗入，全植物水平基因沉默，小麦，玉米

介绍

随着下一代测序( NGS )技术的快速发展和广泛应用，越来越多的植物基因组已经被测序，包括重要的作物，如大麦、小麦、玉米、棉花和番茄 (Schnable et al., 2009; Brauml;utigam and Gowik, 2010; Zhouet al., 2010; Brenchley et al., 2012; Kumar et al., 2012; Liu et al., 2012; Mayer et al., 2012; Paterson et al., 2012; The Tomato Genome Consortium, 2012; Jia et al., 2013; Ling et al., 2013)。因此，大量的新基因已经被发现，需要进行功能分析来解读相关的生物学特性，并探索这些基因的潜在应用。功能分析中广泛使用的方法是使用化学或物理试剂产生突变 (Kodym and Afza, 2003; Belfield et al., 2012; Hanafy and Mohamed, 2014; Serrat et al., 2014; Dhaliwal et al., 2015; Li et al., 2016; Zhang et al., 2016)，T-DNA插入 (Weigel et al., 2000; Alonso et al., 2003)，RNA干扰（RNAi）(Kusaba, 2004; Mahmood-ur-Rahman et al., 2008; Wang et al., 2008, 2013)，或基因组编辑(Shan et al., 2013; Wang et al., 2014; Kumar and Jain, 2015)。但是，这些技术通常会产生大量的技术突变体，并且需要冗长的筛选或遗传转化程序。相比之下，病毒诱导的基因沉默（VIGS）是敲除植物基因的有力工具，即：快速简单，不需要低效繁琐的遗传转化过程，可以克服基因家族的功能冗余，避免不同遗传背景之间的基因型特异性效应，及时靶向组织特异性基因，适合基于某些VIGS载体的大规模功能分析，此外，它是一个有效的基因分析系统，通常一旦突变就会致命 (Dinesh-Kumar et al., 2003; Lu et al., 2003; Burch-Smith et al., 2004; George et al., 2010; Ramegowda et al., 2014)。

作为一项基于转录后基因沉默的技术（PTGS），它利用植物的自然防御系统，提供对入侵病毒的保护。迄今为止，许多病毒基因组已经被修饰为VIGS载体(Dinesh-Kumar et al., 2003; Lu et al., 2003; Unver and Budak, 2009; Becker and Lange, 2010; Senthil-Kumar and Mysore, 2011; Ramegowda et al., 2014)。与其他病毒相比，烟草脆裂病毒（TRV）可以在整个植物中大量传播，并显示出更轻微的感染症状。因此，TRV介导的VIGS (TRV-VIGS )是基因功能分析中最常用的VIGS系统之一(Burch-Smith et al., 2004)。此外，它还能抑制多种植物的基因，如番茄、烟草、拟南芥、玫瑰、棉花、苹果和寄生植物Striga hermonthica(Liu et al., 2002a; Kirigia et al., 2014; Tian et al., 2014; Mustafa et al., 2016)。烟草中的TRV-VIGS可以在4周内完成，并且据报道比其他可用的基因沉默技术更快更容易 (George et al., 2012, 2015; Senthil-Kumar and Mysore, 2014)。然而，很少有人报道TRV-VIGS用于单子叶植物物种，特别是小麦和玉米。大麦条纹花叶病毒（BSMV）介导的VIGS（BSMV-VIGS）是一种有用的谷物基因功能分析工具，已广泛应用于单子叶植物研究，但高效与否取决于微射轰击仪器或体外转录物或烟草的预渗透(Meng et al., 2009; Wang et al., 2011, 2015; Yuan et al., 2011; Chen et al., 2015; Jiao et al., 2015; Zhang et al., 2015; He et al., 2016)这限制了其应用。用于玉米的VIGS工具缺乏，除了源自溴花叶病毒( BMV )的VIGS载体（Ding等，2006）和最近报道的基于黄瓜花叶病毒（CMV）菌株ZMBJ-CMV和狗尾草花叶病毒（FoMV）(Liu et al., 2016; Mei et al., 2016; Wang R. et al., 2016)，然而，通过沉默八氢番茄红素去饱和酶（PDS）基因的光漂白症状是部分的，这表明那些玉米中的VIGS系统无法在整体中发挥作用。

面包小麦（Triticum aestivum L.），有三种密切相关的亚基因组（2n = 42; AABBDD）提供了人类消耗的大约20 %的热量1。由于这种植物在社会和经济上的重要性，人们已经做出了大量努力来表征其基因，并修改其性状，以提高其产量、质量和/或对生物和非生物胁迫的耐受性。作为六倍体植物(基因组为17000兆碱基；大约是水稻基因组的40倍)小麦的大部分基因至少有三个相似的拷贝。它的高倍性和重复DNA含量强烈阻碍了它的前进和反向遗传分析(Smith and Flavell, 1975; Choulet et al., 2010; Fitzgerald et al., 2010; Brenchley et al., 2012; Jia et al., 2013; Ling et al., 2013)。因此，能够同时瞄准一个特定拷贝或几个同源基因拷贝的技术将对小麦的研究非常有益改善其农艺性状。玉米是人类和牲畜的另一种重要卡路里资源。与小麦不同，玉米有一个二倍体基因组，它被广泛用作谷物研究的模式植物，因此玉米基因组(2000 Mb )和遗传学的知识非常丰富具有广泛的相关资源和数据库 (Schnable et al.,2009)。此外，正向和反向遗传技术已经被用于玉米基因功能分析，如基因过表达、RNAi和流行的基因组编辑工具CRISPR / Cas9 (McGinnis et al., 2007; Cho et al., 2014; Liang et al., 2014; Nannas and Dawe, 2015; Feng et al., 2016; Zhu et al., 2016)。然而，这些方法需要费力、耗时、低效的稳定遗传转化。因此，有一个伟大的需要更快、更方便、更高效的功能基因组分析新技术。

在这里，我们报告了一种应用TRV-VIGS的新方法，涉及到小麦、玉米和潜在的其他植物，包括使用真空和用新型渗透溶液共培养农业渗透，这满足了快速、方便和高效的全株基因沉默的需求。

材料和方法

植物材料和白粉病真菌

让小麦cv.Xiaoyan 22和玉米cv.Zhengdan 958在温室下成长，在21℃光照16小时（150mu;mol.m-2.s-1）和19℃黑暗8小时(平均相对湿度55 % )的光周期和热周期下在温室中生长的。遵循先前报告的协议（Cao et al.，2011; Wang et al.，2014），稍作修改，Blumeria graminis f. sp的强毒株。小麦（Bgt）分离物E18保持在小麦cv上。Jing 411植物，保持在相同的光周期和热周期下，但相对湿度为70 %，在生长室内。本研究中使用的生物材料可免费用于研究目的。

——————————————————————

1http://faostat.fao.org/site/339/default.aspx

2http://faostat.fao.org

向量构造

使用的所有寡核苷酸引物（标记为ZJXX）均由Sangon Biotech（中国上海）合成，并在补充表S1中列出。pTRV1和pTRV2 VIGS按照先前报道的方法构建载体的(Liu et al., 2002b)。为了构建pTRV2-SlPDS先前描述的番茄PDS的409-bp片段，是从番茄cDNA扩增cDNA(Liu et al., 2002a)使用的PCR引物为ZJ01和ZJ02。克隆PCR产物通过KpnI和BamHI消化和连接转化成KpnI-BamHI切割的pTRV2。为了构建pTRV2-TaMLO，小麦MLO-B1 cDNA碱基的210-668中获得一个459-bp的片段(Wang et al., 2014)，使用PCR引物ZJ11和ZJ12从小麦cDNA中扩增出。通过EcoRI和BamHI消化将PCR产物克隆到EcoRI-BamHI切割的pTRV2中连接。

真空农业过滤和共培养

小麦cv.Xiaoyan 22和玉米cv.Zhengdan 958的种子通过在75％（v / v）乙醇中浸泡1分钟，用含0.1 %吐温20的2.5 %次氯酸钠浸泡6分钟，然后用无菌去离子水冲洗5次，进行表面消毒。将消毒过的小麦种子放入培养箱中，在30℃下黑暗中发芽30小时，用蒸馏水浸泡2 - 3层滤纸。经过这种处理，新长出的芽长约3毫米。

在补充有100 mg的Luria - Bertani ( LB )培养基中，在28°C下培养待使用的每种根癌农杆菌菌株的10 mL培养物(见下文)。100 mg.L.-1利福平和50mg.L.-1卡那霉素。然后，将200mu;L的每种过夜培养物接种到20 mL的LB培养基中，如上所述使用抗生素，并在28℃下培养，直到它们达到0.04、0.3、0.5、1.0和1.5的选定光密度( OD<su

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料</su

英语原文共 12 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[278934]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word

原文和译文剩余内容已隐藏，您需要先支付 30元 才能查看原文和译文全部内容！立即支付

发小红书推广免费获取该资料资格。点击链接进入获取推广文案即可： Ai一键组稿 | 降AI率 | 降重复率 | 论文一键排版

您可能感兴趣的文章