通过对拟南芥种子中MYB-bHLH-WDR复合物及其靶标的综合分析揭示黄酮类转录调控网络的复杂性和稳健性外文翻译资料

 2023-01-07 11:01

通过对拟南芥种子中MYB-bHLH-WDR复合物及其靶标的综合分析揭示黄酮类转录调控网络的复杂性和稳健性

Wenjia Xu1,2, Damaris Grain1,2, Sophie Bobet1,2, Jose Le Gourrierec1,2, Johanne Thevenin1,2, Zsolt Kelemen1,2, Loeuro;ıc Lepiniec1,2 and Christian Dubos1,2 1

INRA, Institut Jean-Pierre Bourgin, Saclay Plant Sciences, RD10, F-78026 Versailles, France; 2 AgroParisTech, Institut Jean-Pierre Bourgin, Saclay Plant Sciences, RD10, F-78026 Versailles, France

摘要：在拟南芥中，原花色素（PA）积聚在种皮的最内层细胞层（即内皮，角质层和微孔）中。所涉及的生物合成基因的表达依赖于R2R3-MYB和碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）蛋白的转录活性，其与TRANSPARENTTESTAGLABRA1（TTG1）（WD重复蛋白）形成三元复合物（MBW）。鉴定直接靶标以及确定这些MBW复合物的性质和时空活性是全面理解控制类黄酮生物合成的转录机制的重要步骤。在该研究中，使用了各种分子，遗传和生物化学方法。在这里，我们已经证明，在该途径的12个研究基因中，仅二氢黄酮-4-还原酶（DFR），隐色花青素双加氧酶（LDOX），BANYULS（BAN），透明TESTA19（TT19），TT12和H -ATP酶。同种型10（AHA10）是MBW复合物的直接靶标。有趣的是，尽管TT2-TT8-TTG1复合物在开发种子中起主要作用，但还显示了另外三种MBW复合物（即MYB5-TT8-TTG1，TT2-EGL3-TTG1和TT2-GL3-TTG1）。组织特异性的。最后，鉴定MBW复合物的每个靶基因的最小启动子。总而言之，通过回答基本问题并证明或使先前提出的假设无效，本研究提供了一种新的全面的转录调控机制，用于控制拟南芥中的PA和花色素苷生物合成。

关键词: 花青素，拟南芥，顺式元素，原花青素，转录因子，TT2，TT8

前言：黄酮类化合物是次生代谢产物，在植物生长和发育过程中发挥多种功能（Winkel-Shirley，2001;Lepiniec等，2006）。在拟南芥中发现了三类主要的类黄酮，即黄酮醇，花青素和原花色素（PA）。PA，也称为缩合单宁，是由黄烷-3-醇单元缩合产生的黄酮类聚合物，其特别积聚在种皮的最内层细胞层（chalaza，micropyle和endothelium）中，赋予成熟种子特有的棕色（Debeaujon等，2003;Pourcel等，2005;Lepiniec等，2006）。在拟南芥中，大多数黄酮类积累受损的突变体已通过筛选改变的种子色素沉着而分离，这导致透明的种皮（tt）表型（Koornneef，1990）。导致拟南芥种子中PA生物合成的结构基因通常分为两组，即所谓的早期（EBG）和晚期（LBG）生物合成基因（Pelletier等，1999;Lepiniec等，2006）。EBG包括查尔酮合成酶（CHS），查尔酮异构酶（CHI），黄酮醇3-羟化酶（F3H）和黄酮醇3羟化酶（F31H），它们参与前体的生物合成的三类拟南芥黄酮。LBG包含二氢黄酮醇-4-还原酶（DFR），白细胞花青素双加氧酶（LDOX）和BANYULS/花青素还原酶（BAN/ANR）。第三组结构基因，包括TT10（漆酶15），TT12（MATE转运蛋白），TT19（谷胱甘肽-S-转移酶）和AHA10（H ）-ATPase）已被证明参与PA修饰，转运和氧化（Kitamura等，2004;Baxter等，2005;Pourcel等，2005;Marinova等，2007;Routaboul等。，2012）。最后，一种功能尚未明确阐明的基因，即TT15/UGT80B1（UDP-葡萄糖：甾醇-葡糖基转移酶），已被证明会影响种子中的PA积累过程。TT15催化甾基糖苷的合成，其反过来影响脂质聚酯前体的运输，并且最可能间接地影响PA积累（DeBolt等人，2009）。大量研究表明，参与类黄酮生物合成途径的基因的表达受组织或物种特异性方式的不同机制控制（Winkel-Shirley，2001;Koes等，2005;Lepiniec等，2006）;Petroni＆Tonelli，2011;Schaart等，2013）。该调节涉及对每类类黄酮特异的不同转录调节剂组。在拟南芥中，EBGs和FLAVONOLSYNTHASE1（FLS1，导致黄酮醇的积累）表达受至少三个控制R2R3-MYBs，即 PFG1/MYB12， PFG2/MYB11 PFG3/MYB111（Stracke等，2007）。PA和花青素生物合成的调节涉及特异性R2R3-MYB（亚组5和6）和R/B样碱性螺旋-螺旋（bHLH）（亚组IIIf）转录因子（TF）以及透明TESTAGLABRA1的联合作用。（TTG1）（WD重复蛋白），在MYB-bHLH中-WDR（MBW）三元蛋白复合物（Hei等，2003;Baudry等，2004;Zimmermann等，2004;Lepiniec等，2006;Dubos等，2010;Thevenin等，2012）。在营养组织中，花色素苷生物合成受不同MBW复合物的调节，包括生产花青色素1（PAP1）/MYB75和PAP2/MYB90，与GLABRA3（GL3）/bHLH00，GLABRA3增强剂（EGL3）/bHLH002，TT8/bHLH042组合。和TTG1（Zhang等人，2003;Baudry等人，2006;Feyissa等人，2009;Appelhagen等人，2011a）。在种子中，TT2/MYB123，TT8和TTG1是主要的PA生物合成调节剂（Lepiniec等，2006）。TT2-TT8-TTG1蛋白复合物直接调节BAN的表达，BAN编码第一种致力于PA生物合成途径的酶（Baudry等，2004）。此外，DFR和LDOX是TTG1：GR嵌合蛋白的直接靶标（TTG1与糖皮质激素受体之间的翻译融合;Gonzalez等，2008）。此外，最近两项关于TT1/WIP1（WIP锌指）的研究表明，控制PA生物合成和积累的转录调控网络可能更多，该TF被假设用于调节内皮细胞合成和积累PA的能力。比以前认为的更复杂（Appelhagen等，2010,2011b）。TT1可与TT2-TT8协同作用-TTG1复合物调节EBG的表达，例如CHS，如在营养发育期间已经建议用于其他MBW复合物（Borevitz等，2000;Tohge等，2005;Appelhagen等，2011a，b）。此外，MYBL2（R3-MYB），在PA-积累细胞MBW复杂转录活性的负调节剂，的过表达导致功率放大器和LBGs，CHS，F3H和F3的下部积累ħmRNA水平（杜伯士等人。，2008）。后一发现可能是负代谢反馈或EBG转录激活因子的负调控的结果。在这方面，还显示TT8启动子活性本身由TT1部分调节（Xu等人，2013）。从这些研究中，很有可能推测MYBL2也可能抑制TT2的活性-TT8-TTG1络合物和TT1TF（齐默尔曼等人，2004;杜伯士等人，2008;Appelhagen等人，2011A。）。最后，涉及MYB5和EGL3或GL3的功能冗余可能在这个调节过程中发挥作用，但是可能由这些额外的TF直接调节的结构基因集仍有待鉴定（Baudry等，2004;Lepiniec等。。，2006;Gonzalez等，2009）。TF通过与特定DNA顺式调节元件的相互作用调节其靶基因的表达，所述顺式调节元件通常位于转录区域的上游（在启动子内）。因此，鉴定这些顺式元件是全面理解转录调控的重要步骤。先前通过对BAN启动子活性的研究探索了TT2-TT8-TTG1复合物调节其靶基因的方法，允许在翻译起始位点上游鉴定236bp长的最小启动子（Debeaujon等。。，2003;Baudry等，2004;Thevenin等，2012）。在这些研究中，具体的R2R3-MYB和的bHLH结合位点，通过该TT2-TT8-鉴定和表征TTG1复合物调节BAN表达。在涉及毛状体和根毛分化的关键拟南芥基因（即GL2，CAPRICE（CPC），TTG2和MYB23）的启动子中也鉴定出类似的顺式调节基序，其中额外的MBW复合物（涉及GL1/MYB0，WEREWOLF（WER）））/MYB66或MYB23与GL3，EGL3和TTG1）一起调节它们的表达（Koshino-Kimura等，2005;Ryu等，2005;Ishida等，2007;Kang等，2009;Song等。。，2011）。总之，这些研究表明，MBW转录调控复合物可能通过与MYB和bHLH顺式调控基序的特异性相互作用来调节其整个靶基因的表达，尽管这仍有待证实。在这项研究中，采用遗传，生物化学和分子方法的组合，以剖析由MBW复合物编排的PA生物合成基因的调节。通过表征mRNA积累水平（使用定量逆转录聚合酶链反应，qRT-PCR）和启动子活性（使用b-葡糖醛酸酶（GUS）报告基因）对所谓的EBGs进行基因表达调控。和LBG，以及TT10，TT12，TT15，TT19和AHA10，在单个和多个功能丧失突变体背景中。该策略显示只有DFR，LDOX，BAN，TT12，TT19和AHA10受TT2-TT8监管-TTG1复杂。使用表达诱导型TTG1：GR嵌合蛋白的转基因植物显示这些基因是MBW复合物的直接靶标。遗传分析表明，种子和幼苗中除TT19外，所有直接靶基因均具有部分重叠和冗余的转录调控活性。我们发现MYB5仅在内皮中与TT2冗余，而TT8，EGL3和GL3在chalaza区域共同作用。使用Physcomitrellapatens原生质体和拟南芥种子中的瞬时和稳定转化测定，通过启动子缺失策略研究这些MBW复合物与其靶基因的启动子相互作用的方式。合在一起，

材料和方法

除非下文另有说明，否则本研究中使用的所有引物均在支持信息表S1中描述。

植物材料在适当的情况下，将拟南芥（L.）Heynh种质Wassilewskija（WS）和Landsbergerecta（Ler）用作野生型（WT）对照。拟南芥tt2-1，tt8-3，ttg1-1，tt8egl3，tt8gl3egl3和myb5-1突变体系，以及过表达与GR结构域融合的TTG1的细胞系已在别处描述过（Debeaujon等。，2003;Zhang等，2003;Baudry等，2004;Gonzalez等，2009）。本研究中使用的tt2myb5双突变体系是通过将tt2-1与myb5-1杂交获得的。如先前报道的那样进行转基因株系的植物生长，转化和选择（Nesi等，2000）。

研究拟南芥基因ID

TT2/MYB123,At5g35550;MYB5,At3g13540;TT8/bHLH042,At4g09820;GL3/bHLH001,At5g41315;EGL3/bHLH002,At1g63650;TTG1,At5g24520;CHS,At5g13930;CHI,At2g43570;F3H,At3g51240;F3H,At5g07990;DFR,At5g42800;LDOX,At4g22880;BANYULS/ANR,At1g61720;TT10,At5g48100;TT12,At3g59030;TT15,At1g43620;TT19,At5g17220;AHA10,At1g17260。

结构体

proOsActine：TT2，proOsActine：MYB5，proOsActine：TT8，proOsActine：GL3，proOsActine：EGL3和proOsActine：TTG1载体用于表达苔藓P.patens原生质体中的相应基因已在别处描述过（Thevenin等，2012）;Xu等，2013）。使用来自WS基因组DNA的高保真PhusionDNA聚合酶（ThermoScientific-Finnzymes，Waltham，MA，USA）通过PCR扩增本研究中的所有启动子（范围从0.5至2kb，其对应于整个基因间区域），和随后重组进pDONR207载体（BP网关reg;根据制造商的说明反应），并测序，以确保其完整性。然后通过LR反应（Gateway）将启动子插入目的载体中。用于启动子的目的载体是pBSTPp-B（绿色荧光蛋白（GFP）报告基因;Thevenin等，2012）和pGWB3（GUS报告基因;Nakagawa等，2007），用于P.patens原生质体转染试验。和拟南芥稳定转化。从插入pGWB3载体中的启动子扩增5缺失片段作为模板并如上所述克隆。通过在反向引物的5末端之前添加35S花椰菜花叶病毒（CaMV）最小启动子序列来修饰用于扩增的引物。proTT8：MYB5载体通过如上所述的LR重组从以下两种载体产生：proTT8：GTW（TT8启动子）和pDONR207-MYB5（MYB5编码序列）。两种载体已在别处描述（Dubos等，2008;Xu等，2013）。

P.patens原生质体中的瞬时表达测定

如前所述（Thevenin等，2012）进行苔藓培养，原生质体制备，原生质体转化和流式细胞术测量分析。每个实验重复至少三次，每次实验重复三次。

表达分析

从4-d-oldsiliques中提取总RNA，用DNA酶处理，逆转录成cDNA，并如前所述使用qRTPCR进行测定（Baudry等，2004,2006）。在本研究中为CHS，CHI，F3H，F3中所用的引物对“H，DFR，LDOX，BAN/ANR和TT10已经别处描述（Baudry等人，2004，2006;杜

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