阿尔茨海默病小鼠模型早期髓鞘形态和少突胶质细胞发育的变化外文翻译资料

 2023-03-28 11:03

阿尔茨海默病小鼠模型早期髓鞘形态和少突胶质细胞发育的变化

作者：Yu Wua,1, Yuanlin Maa,1, Zhuo Liua,b,1, Qi Genga, Zexin Chena, Yan Zhanga,*

单位：State Key Laboratory of Membrane Biology, College of Life Sciences, PKU-IDG/McGovern Institute for Brain Research, Peking University, Beijing, 100871, China

摘要：阿尔茨海默病（AD）是痴呆最常见的原因，预计到2050年底将影响约3500万人。在本研究中，我们发现2月龄APP/PS1小鼠海马组织的髓鞘形态发生改变。APP/PS1小鼠的髓鞘较厚，节间距离较短。少突胶质细胞由少突胶质前体细胞（OPCs）分化而来，在中枢神经系统（CNS）中负责髓鞘的形成和维持。我们目前的研究结果表明，2月龄APP/PS1小鼠的少突胶质细胞发育紊乱。通过蛋白免疫印迹检测发现APP/PS1小鼠海马组织中III型神经调节蛋白1（Neuregulin-1 type III）上调，该蛋白对少突胶质细胞的发育和CNS中髓鞘的形成至关重要。此外，我们发现活化的半胱氨酸蛋白酶caspase-6可以在细胞质区域切割III型神经调节蛋白1。综上所述，本研究表明2月龄APP/PS1小鼠的髓鞘形态和少突胶质细胞发育发生改变，并且这些改变可能与III型神经调节蛋白1以及活化的caspase-6密切相关。

关键词：髓鞘化；少突胶质细胞；阿尔茨海默病；III型神经调节蛋白1；活性caspase-6

1引言

阿尔茨海默病（AD）是导致65岁以上老年人痴呆的最常见原因，预计到2050年底将影响约3500万人[12]。以往的研究表明，与同龄的对照组相比，AD患者的磁共振成像（MRI）结果显示其白质区域出现萎缩。白质萎缩是AD除淀粉样蛋白斑块和神经纤维缠结外的另一种病理特征[11,14,16]。

在中枢神经系统（CNS）中，由少突胶质前体细胞（OPCs）分化而来的成熟少突胶质细胞负责髓鞘[17]的形成。越来越多的证据表明，少突胶质细胞在阿尔茨海默病细胞阶段的作用[3,7]。髓鞘沿着轴突提供不连续的绝缘，在跳跃脉冲传导中起着关键作用，在生理功能中至关重要。在人类中，髓磷脂的发育从婴儿期开始，一直持续到二十多岁[2,8]。考虑到髓鞘的关键作用，髓鞘发育的破坏可能导致神经元间通讯效率低下。

由神经调节蛋白-1（NRG1）基因编码的III型神经调节蛋白1（Neuregulin-1 type III）在外周神经系统（PNS）髓鞘形成中发挥着重要作用。以往研究表明，III型神经调节蛋白1并非必需，但在中枢神经系统髓鞘形成中也起着重要作用[4,15]。少突胶质细胞负责CNS髓鞘的形成和维持，并且少突胶质细胞的发育与来自轴突的神经调节蛋白1密切相关[1,5,10]。先前的研究表明，编码III型神经调节蛋白1的cDNAs过表达的小鼠，其白质中发现大量高髓鞘化的轴突，提示III型神经调节蛋白1可能与中枢神经系统髓鞘化有关，但机制尚不清楚。

APP/PS1小鼠被称为阿尔茨海默病小鼠模型，直到6个月大时才显示出行为缺陷。6月龄及以上的APP/PS1小鼠会出现髓鞘受损和脱髓鞘现象，这与2月龄APP/PS1小鼠的表型不同。我们目前的研究结果表明，2月龄APP/PS1小鼠海马组织髓鞘形态和少突胶质细胞发育的改变出现在行为缺陷和大多数其他病理特征发生之前。根据进一步的结果，我们提出III型神经调节蛋白1和活性caspase-6对APP/PS1小鼠改变的关键贡献。

2材料和方法

2.1 小鼠

APP/PS1（APPswe/PS1Delta;E9）小鼠购于南京大学模式动物研究所，并遵循北京大学动物的管理与使用指南。基因分型采用了杰克逊实验室描述的方法。所有动物实验均在北京大学实验动物福利伦理委员会的指导下进行。

2.2 免疫荧光

为了固定脑组织，WT和APP/PS1小鼠均被麻醉并灌注4%多聚甲醛（PFA），PFA用磷酸盐缓冲液（PBS）进行稀释。用常规方法制备35 mu;m厚的脑载玻片，加5%的牛血清白蛋白（BSA/PBS）阻断，与一抗孵育。细胞培养物用4% PFA/PBS固定。5% BSA/PBS阻断后，细胞培养物与一抗孵育。使用以下一抗：Caspr （75-001, NeuroMab, 1:1000）， MBP （40390, Abcam, 1:1000）， Caspase-6 （BS7006, Bioworld, 1:1000）。用PBS洗涤后，将脑载玻片和细胞培养物与二抗在室温（RT）下孵育1小时。二抗体与Alex-Fluor-Dye偶联，均购自Life Technology, 1:500稀释。用DAPI （Sigma）将细胞核染色。我们处理了三对APP/PS1小鼠和WT对照组，并分析了每组10个脑切片中至少103个有髓鞘的轴突。

2.3 免疫印迹

检测海马组织，用蛋白酶抑制剂（Roche）和磷酸酶抑制剂（Roche）制成的裂解缓冲液（20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100）匀浆提取海马组织。在100℃变性5分钟后，用10%或12% SDS-PAGE分离蛋白质。使用以下一抗与转印膜孵育：III型神经调节蛋白1 （BS1173, Bioworld, 1:500）， Mbp （7349, Abcam, 1:2000）， NG2 （5320, Millipore, 1:2000）， CNPase （BS3461, Bioworld, 1:1000）， GAPDH （BE0034, EASYBIO, 1:5000）。HRP偶联的二抗均购自EASYBIO，稀释比例为1:500。用化学发光法检测HRP。

2.4 电子显微镜

小鼠麻醉后，用0.1 M二甲胂酸钠缓冲液配制4% PFA和2.5%戊二醛的混合液进行灌注固定。从WT和APP/PS1小鼠中检测海马组织，用2%的四氧化锇（OsO4）后固定2小时。再用4%的醋酸铀酰对细胞膜进行染色。胼胝体经梯度浓度酒精脱水后，用环氧丙烷和Spurr树脂浸润，然后嵌入Spurr树脂。通过透射电镜（Tecnai G2 20 Twin, FEI）获得超微结构图像，并使用Image j进行分析。我们在每组（n = 3）中测量了至少40个有髓鞘的轴突。

2.5 体外切割试验

III型神经调节蛋白1细胞质区（如FL所示）的表达和纯化如[6]之前所述。用与脱盐柱（20 mM Tris-HCl pH 7.5, 200 mM NaCl）相同的缓冲液将FL III型神经调节蛋白1稀释至0.5 mu;g/mu;l，加入5 ng/mu;l 活性caspase-6 在37℃下孵育。每分钟取出一部分蛋白溶液，在100℃下变性5分钟，直到超过1小时。不同孵育时间的蛋白样品用15% SDS-PAGE进行分析。

2.6 统计分析

数据使用GraphPad Prism 6进行分析，采用双尾配对学生t检验进行统计学意义判定。

3结果

3.1 2月龄APP/PS1小鼠海马组织髓鞘形态的改变

与同龄的WT小鼠相比，2月龄APP/PS1小鼠海马组织中成熟少突胶质细胞和髓鞘的主要成分髓鞘碱性蛋白（Myelin basic protein, MBP）表达上调（图1A）。为了研究APP/PS1小鼠MBP水平的升高是否与髓鞘形成异常有关，我们采用透射电镜研究了髓鞘的超微结构。我们发现，与同龄的WT小鼠相比，APP/PS1小鼠海马组织轴突髓鞘单位的超微结构较为规则，但髓鞘的厚度要厚得多，这是由于附加膜包裹所致（图1B）。测量轴突（daxon）和纤维（轴突和髓鞘）（dfiber）的直径，并引入g值（daxon/dfiber）来表示髓鞘的相对厚度。与平均g值为0.84的WT （n = 41）不同，APP/PS1 （n = 45）出现高髓鞘化，平均g值为0.75 （p lt; 0.001）（图1C）。不仅是髓鞘厚度，APP/PS1小鼠的节间长度、连续节点间距离也与WT小鼠有较大差异。对WT和APP/PS1小鼠35mu;m脑切片进行抗caspr（结侧区标记物）和抗MBP（髓鞘标记物）免疫染色，以便标记和量化节间距离（图1D）。与WT（n = 103）相比，APP/PS1小鼠（n = 127）的节间长度显著减少（图1E）。

图1 2月龄APP/PS1小鼠海马组织髓鞘形态发生改变。（A）对2月龄WT和APP/PS1小鼠海马组织制备的蛋白提取物进行Western blot分析（上）。与WT对照相比，APP/PS1小鼠MBP水平上调（下）。数据代表平均值plusmn;SE，** p lt; 0.01。（B）2月龄APP/PS1小鼠的透射电镜观察发现海马组织中存在具有规则轴髓细胞单位的高髓鞘化轴突。比例尺：200 nm。（C）与WT小鼠相比，APP/PS1小鼠相对髓鞘的g值（daxon/dfiber）显著降低。数据代表平均值plusmn;SE（WT组n = 41, APP/PS1组n = 45），与WT相比，p lt; 0.001。（D）用抗mbp和抗caspr免疫染色35mu;m脑切片，显示具有代表性的共焦图像。比例尺：20 mu;m。（E）量化显示APP/PS1组的节点间长度（连续节点之间的距离）显著减少。数据代表平均值plusmn;SE（WT组n = 103，APP/PS1组n = 127），*** p lt; 0.001。

3.2 2月龄APP/PS1小鼠海马组织少突胶质细胞发育的变化

成熟少突胶质细胞由少突胶质前体细胞（OPCs）分化而来，能够包裹轴突形成髓鞘。硫酸软骨素蛋白多糖（NG2）在OPCs中特异性表达，常作为OPCs的标记物。2, 3-环核苷酸 3-磷酸二酯酶（CNPase）被用于标记从OPCs分化而来的前少突胶质细胞，并进一步分化为成熟的少突胶质细胞。我们的结果表明，与同窝出生的WT小鼠相比，2月龄APP/PS1小鼠的海马组织中NG2和CNPase均上调（图2）。基于这一结果，我们猜想2月龄APP/PS1小鼠的少突胶质细胞发育可能出现紊乱。

图2 2月龄APP/PS1小鼠少突胶质细胞发育异常。免疫印迹分析2月龄WT和APP/PS1小鼠海马组织的蛋白提取物。NG2作为OPC的特异性标记物，CNPase作为前少突胶质细胞的特异性标记物。定量结果显示2月龄APP/PS1小鼠的NG2和CNPase水平显著升高。数据代表平均值plusmn;SE，* p lt; 0.05。

3.3 APP/PS1小鼠III型神经调节蛋白1的上调

III型神经调节蛋白1在PNS髓鞘形成中起重要作用，但在CNS髓鞘形成中并不是必需的。以往研究报道表明，III型神经调节蛋白1的过表达可诱导CNS高髓鞘化，其机制尚不清楚。本研究对2月龄的WT和APP/PS1小鼠海马组织进行检测，用裂解缓冲液提取蛋白质。蛋白裂解液的免疫印迹分析显示，APP/PS1小鼠中III型神经调节蛋白1的水平显著升高（图3A）。生物信息学分析结果显示，caspase-6的切割位点在6种神经调节蛋白1的亚型中都是保守的（数据未显示）。为了验证caspase-6是否可以切割III型神经调节蛋白1，我们进行了体外切割实验。如[6]之前讨论过那样表达和纯化的III型神经调节蛋白1的细胞质区域（如图FL所示），稀释后与纯化的活性caspase-6在37℃下孵育。孵育60分钟，在此时间内每分钟取出一些蛋白溶液，在100℃下变性以停止反应。用15% SDS-PAGE分析不同孵育时间的蛋白溶液。随着时间的推移，III型神经调节蛋白1（如图FL）的细胞质区域逐渐减少，最终在孵育结束时消失，而n端片段则逐渐增多（图3B）。体外切割实验结果表明caspase-6可以将III型神经调节蛋白1切割成两个片段。此外，我们还研究了caspase-6和III型神经调节蛋白1在HEK293细胞中的位置。将带有GFP标记的编码III型神经调节蛋白1的cDNA转染到HEK293细胞内。在共聚焦显微镜下，我们发现III型神经调节蛋白1（绿色）定位于细胞膜。用抗活性caspase-6抗体或抗前caspase-6抗体对HEK293细胞过表达的III型神经调节蛋白1进行免疫染色。共聚焦显微镜图像显示，活化的caspase-6（红色）与III型神经调节蛋白1共定位于细胞膜，而前caspase-6（红色）广泛分布于细胞质中（图3C）。根据体外切割实验和体内免疫细胞化学实验的结果，我们可以猜想III型神经调节蛋白1可能被活性caspase6切割。根据前期研究，III型神经调节蛋白1可以被beta;-淀粉样前体蛋白切割酶1（BACE 1）切割[10]，且BACE 1在中枢神经系统髓鞘形成中起关键作用[9]。为了研究BACE

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