茶树MTP基因家族的鉴定及CsMTP8.2对锰胁迫的响应外文翻译资料

茶树MTP基因家族的鉴定及CsMTP8.2对锰胁迫的响应

原文作者：

张旭阳^a 李清辉^c 徐文峦^a 赵华^a 郭飞^a 王璞^a 王郁^a 倪德江^a 王明乐^a 韦朝领^b

单位：

^a园艺植物生物学重点实验室（教育部），园艺与林业科学学院，华中农业大学，武汉430070，中国

^b茶树生物学与利用国家重点实验室，安徽农业大学，合肥，230036，中国

^c农业微生物国家重点实验室，华中科技学院，华中农业大学，武汉，430070,中国

摘要：阳离子扩散促进剂(CDFs)在维持植物金属稳态和植物金属耐受性方面有关键作用，但茶树CDF编码基因的具体功能及其机制尚不清楚。此前，已有转录组测序结果表明，在Mn² 过量的条件下，茶树芽中CsMTP8.2的表达下调。为了阐明其作用机制，本研究系统地鉴定了来自3个亚族的13个CsMTP基因，并对其系统发育、结构和编码蛋白的特征进行了表征。高浓度的Mn、Zn、Fe和Al对CsMTP基因转录的调控存在差异。CsMTP8.1和CsMTP8.2启动子中顺式调控元件有差异，这表明两个基因的表达可能受到差异调控。瞬时表达分析表明，CsMTP8.2位于烟草和洋葱表皮细胞的质膜上。此外，CsMTP8.2在酵母中异源表达时，对Ni和Mn具有耐受性，而对Zn没有耐受性。此外，CsMTP8.2在拟南芥中的异源表达表明，CsMTP8.2通过降低植物中锰的积累，正向调控植物对锰毒性的响应，而其他金属，如Cu、Zn、Fe的积累没有差异。这些结果表明，CsMTP8.2是一种锰特异性的转运体，有助于植物细胞中多余的Mn² 的流出。

关键词：茶树； CDF家族； CsMTP8.2； 表达量分析； 锰耐受性； 质膜

1 引言

锰(Mn)、锌(Zn)和铁(Fe)是植物生长、发育和正常代谢所必需的微量元素，在许多生化过程中都很重要，但这些元素过量则可能对植物产生毒性，导致作物产量和质量的下降(Ghori et al.，2019)。作为固着生物，植物已经进化出了一系列应对外部金属胁迫的机制(Kushwaha et al., 2016; Singh et al., 2016)。许多调控金属外排和隔离的金属转运体对植物的金属耐受性有关键作用，如自然抗性相关的巨噬细胞蛋白类(Peng et al., 2018)，重金属ATPase(Hussain et al., 2004)和阳离子扩散促进剂(CDF)(Delhaize et al.，2003)。CDF家族在维持Mn、Zn和Fe的稳态中有重要作用(Shao et al.，2017；Socha and Guerinot，2014)。

根据底物特异性的不同，CDF家族被分为三个亚家族，即Mn-CDF、Zn-CDF和Zn/Fe-CDF，(Montanini et al.，2007)。在植物中，CDF家族成员也属于金属耐受蛋白(MTPs)。拟南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza sativa)MTP家族分别由12个和10个成员组成。MTP蛋白主要参与Mn、Zn和Fe的运输，也可以运输Cd、Co、Cu和Ni(Ricachenevussy et al.，2013)。目前，功能特征最明晰的MTP蛋白是MTP8，它将锰封存在液泡中，从而降低锰对拟南芥(Eroglu et al.，2016)、水稻(Chen et al., 2013; Takemoto et al., 2017)和黄瓜(Migocka et al., 2014)的毒性。在大麦(Hordeum vulgare)中，MTP8.1和MTP8.2将Mn转运到高尔基体上(Pedas et al.，2014)。最近，研究人员证实了拟南芥AtMTP8在种子发育和萌发过程中对Fe的重新分配和Mn稳态的重要性(Eroglu et al.，2017)。尽管许多MTP家族基因已在非模式植物中被鉴定，如小麦(Triticum aestivum) (Vatansever et al., 2017)、柑橘(Citrus sinensis)(Fu et al., 2017)、油菜(Brassica rapa)(Li et al., 2018)和白梨(Pyrus bretschneideri Rehd) (Hou et al., 2019)，但目前尚不清楚其他植物物种中相似的MTP基因是否在功能上相似，特别是木本植物中的Mn-CDF成员。

茶树(Camellia sinensis L.)被列为锰超积累植物，茶叶组织中的锰浓度为约1000 mg/kg。(Yemane et al., 2008)。茶树的最适土壤pH值为4.5 ~ 5.5(Yan et al., 2020)。种植茶叶后，土壤pH值降低，导致土壤中可交换锰的量增加(Fung and Wong, 2002)。但茶树在Mn过量的酸性土壤中仍能很好地生长，人们对这其中所涉及的具体原因仍知之甚少。例如，CsMTP8，即本研究中的CsMTP8.1，是第一个被确定的Mn特异性转运体编码基因，其编码的蛋白通过增强酵母和拟南芥中的锰的外排，在锰稳态中发挥重要作用(Li et al., 2017)。此外，异源表达CsMTP11增加了转基因酵母对Mn和Co的耐受性(Yuan et al., 2017)。为了系统地探讨茶树中Mn积累的分子机制，本研究重点关注专门参与锰稳态的MTP家族，从茶树中鉴定了13个CsMTP基因，分析了鉴定出的CsMTP基因的序列和结构特征，并确定了CsMTP基因的表达谱。此外，结合转录组分析，本研究还发现过量的Mn² (50 mu;M/15d)处理后，CsMTP8.2的表达(Log2 Fold-change)下调约2.32倍，因此，本研究对CsMTP8.2在植物对锰毒性反应中的作用进行了功能表征。本研究的结果补充了一些CsMTP8.2分子在植物中起作用的细节，可为今后研究茶树耐锰的分子机制提供参考。

2 材料和方法

2.1 植物材料和生长条件

在中国武汉华中农业大学茶树种质资源苗基地（北纬30°28′0Prime;，东经114°22′08Prime;E；海拔48.0米），以水培方式培养茶树(C. sinensis cv. “Zhongcha 108”)至二年龄，从2017年10月15日到2017年11月21日，营养液（pH值5.0）每5天更新一次，第39天时，在茶树营养液中分别添加50 mu;M MnSO₄、1.25 mM Al₂(SO₄)₃、210 mu;M FeSO₄或51 mu;M ZnSO₄(Wang et al., 2017)。在第1天、第4天和第7天收集幼枝（一个芽和两片叶）和根，用于随后的RNA提取。所有操作均以四个生物重复完成。

2.2 CsMTP基因的鉴定

利用已被鉴定的拟南芥、水稻和毛果杨MTP基因(Montanini et al., 2007)的开放阅读框(ORFs)在BLAST中以默认参数值查询CsMTP基因(Wei et al., 2018; Xia et al., 2017)，结合本实验室已有的茶树转录组学数据(Wang et al., 2019)初步筛选，以获得MTP序列。为了确认序列的准确性，使用基因特异性引物（表S1）扩增所有候选基因，在pTOPO钝性载体（Aidlab，中国北京）中亚克隆，并测序（TSINGKE，中国北京）。此外，使用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/）和CCD程序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)对筛选出的序列进行再次验证。

2.3 生物信息学分析

在ExPASy(http://web.expasy.org/compute_pi/)上获取CsMTPs的分子量和理论等电点。分别用WoLFPSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)和TMHMMServer（2.0版）(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测亚细胞定位和跨膜结构域的数量。根据邻接法以MEGA（5.0版）默认参数构建MTP蛋白的系统发育树，Multalin(version 5.4.1) (http://meme-suite.org/tools/meme）用于分析保守的基序。序列与Multalin（版本5.4.1）一(Corpet, 1988)。此外，利用PlantCARE数据库预测启动子区域的顺式调控元件(Lescot et al., 2002)。

2.4 定量RT-PCR和半定量RT-PCR分析

使用RNA分离试剂盒（中国北京华越洋）从茶树和拟南芥样品中提取总RNA，然后使用1 mu;g RNA作为模板，使用TransScriptreg;II All-in-One First strand cDNA Synthesis SuperMix进行反转录，用于qPCR(One-Step gDNA)（TransGen Biotech，中国北京）。聚合酶链反应（PCR）检测在StepOne Plustrade; Real Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)中使用TransStartreg;Top Green qPCR SuperMix（TransGen Biotech）完成。重金属胁迫条件下，18s rRNA和PP2AA3表达水平的稳定性此前已得到证实(Wang et al., 2017)，因此，根据2^{-Delta;Delta;CT}法（Livak and Schmittgen，2001），以它们作为正常CsMTPs表达水平的内参。此外，采用qRT-PCR和RT-PCR方法检测CsMTP8.2在转基因植株中的表达水平。以AtACTIN2(At3g18780)作为内参基因(Zhou et al., 2012)。用于qRT-PCR和RT-PCR分析的引物列于表S1。

2.5 启动子分离

用CTAB法从中茶108号幼芽中提取基因组DNA(Porebski et al., 1997)。分别利用引物对p8.1-F/-R和p8.2-F/-R（表S1），参照“Shuchazao”的基因组序列扩增CsMTP8.1和CsMTP8.2启动子序列，将扩增产物（分别为pMTP8.1和pMTP8.2）亚克隆到pTOPO-T载体（Aidlab）中，然后测序。

2.6 CsMTP8.2在酵母中的异源表达

扩增CsMTP8.2后插入pYES2酵母表达载体(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中，将重组载体和空载体分别转化为宿主菌株INVSc1，具体方法参照S. c. EasyComptrade; Transformation 试剂盒(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)，随后对酵母菌转化子进行了金属耐受性测定(Li et al., 2017; Chen et al., 2013)。

2.7 转基因拟南芥的培养

使用PrimeSTARreg;GXL DNA聚合酶（TaKaRa）和CsMTP8.2扩增ORF（无终止密码子）。将扩增产物亚克隆到植物表达载体pCAMBIA2300–GFP的KpnI和XbaI位点。通过根癌农杆菌（菌株EHA105）介导的花浸法（Zhang等人，2006）将GFP转化为野生型（WT）拟南芥。在含有琼脂固化的Murashige和补充有50 mu;g ml 1卡那霉素的MS培养基的培养皿中筛选纯合T3植株。

2.8 拟南芥的金属耐受性测定

将野生型拟南芥植株和CsMTP8.2过表达株进行表面灭菌，然后将其移种到分别含有2 mM Mn² 和250 mu;M Zn² 的MS培养基上，在培养箱（22℃，16 h光照，180 mu;mol m^-2 s^-1 ；20℃，8 h黑暗）中培养2周后，测定幼苗鲜重、根长和其体内Mn² 和Zn² 的浓度。所有操作均以四个生物重复完成。

2.9 CsMTP8.2在烟草和洋葱表皮细胞中的亚细胞定位

为了实现CsMTP8.2在烟草(Nicotiana be

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