OsCaM1-1过表达水稻植株减轻了盐胁迫诱导的氧化损伤外文翻译资料

 2023-03-28 11:03

OsCaM1-1过表达水稻植株减轻了盐胁迫诱导的氧化损伤

作者：T. KAEWNERAMIT, T. BUABOOCHA, P. SANGCHAI, and N. WUTIPRADITKUL*

单位：Department of Biochemistry, Faculty of Science, Chulalongkorn University, Patumwan, Bangkok 10330, Thailand

摘要：

将OsCaM1-1过表达水稻植株和野生型KDML105于150 mMol NaCl溶液中处理后3天，比较两者中与耐盐性相关的各种生理生化参数。结果表明，转基因植株的相对含水量、相对生长速率、光合色素（叶绿素a、b和类胡萝卜素）含量、DPPH清除活性、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶活性均高于野生型和用空白载体转化KDML105的对照组，而H2O2含量、Na/K和Na/Ca比值、膜脂过氧化和电解质渗漏较低。综上所述，OsCaM1-1基因的过表达可能通过增强抗氧化酶的活性来减少转基因植物中盐胁迫诱导的氧化损伤。

关键词：抗氧化活性、钙调素、类胡萝卜素、叶绿素、NaCl、活性氧

1引言

高盐浓度、干旱和极端温度等各种非生物胁迫对作物的生长、发育和产量产生不利影响。植物受这些胁迫影响可能会产生渗透胁迫、氧化胁迫和蛋白质变性。同时，植物通过积累相容性溶质、应激蛋白和抗氧化剂来保护自身。活性氧（ROS）会对DNA以及绝大部分活细胞的有机组分造成损伤。因此，在所有植物中都存在一个能高效去除活性氧对植物毒害的抗氧化系统。植物已经进化出一系列酶和非酶抗氧化剂。主要的活性氧清除酶包括超氧化物歧化酶（SOD:EC1.15.1.1）、抗坏血酸过氧化物酶（APX:EC1.11.1.11）、过氧化氢酶（CAT:EC1.11.1.6）、谷胱甘肽还原酶（GR:EC1.8.1.7），非酶抗氧化剂包括抗坏血酸和谷胱甘肽。

真核生物利用胞浆Ca2 的变化作为第二信使，产生细胞对多种细胞外刺激的反应，包括非生物和生物胁迫以及植物激素（如脱落酸（ABA））。Ca2 通过几个Ca2 传感器或Ca2 结合蛋白（如钙调素（CaM）、钙依赖性蛋白激酶（CDPK）和钙调神经磷酸酶B样蛋白（CBL）向下游传递应激信号，调节细胞内的生理反应(。钙调素是所有真核细胞中主要的钙离子传感器。它能结合钙离子调节多种效应蛋白对钙信号的反应。钙调素基因家族已在包括水稻在内的几种植物中被鉴定，水稻中有五个OsCam基因。OsCam1-1、OsCam1-2和OsCam1-3编码相同的蛋白质OsCam1，而OsCam2和OsCam3编码的蛋白质与典型CaM只有两个氨基酸差异，与OsCam1具有98.7%的氨基酸序列同源性。OsCaM1-1编码一种功能性钙结合CaM，并在维管束组织和侧根中高度表达。OsCaM1-1在渗透胁迫和盐胁迫条件下被诱导表达。此外，与对照植株相比，过表达OsCam1-1的转基因水稻植株表现出ABA生物合成能力的增强和耐盐性的提高。Chaicherdsakul 等(2017)还提出钙调素调节的耐盐性可能是通过氧化还原信号和保持内环境稳态的机制来进行的。总之，OsCam1-1可提升水稻的抗盐性。因此，我们研究了盐胁迫下诱导过表达OsCam1-1的转基因植物中的抗氧化系统和其他生理变化，并将其与野生型和没有过表达OsCam1-1的对照转基因株系进行比较。

2.材料和方法

生长条件与样品处理：籼稻种子Khao Dawk Ma Li 105 (KDML105)来自泰国曼谷农业和合作社部农业部。在35SCaMV启动子（35SCaMV-OsCaM1-1）的控制下的含有OsCaM1-1基因的转基因水稻植株之前是通过农杆菌介导的pCAMBIA1301质粒转化构建的。将三株过度表达OsCaM1-1的转基因水稻植株的种子、仅含有来自pCAMBIA1301的T-DNA的转基因系作为阴性对照，以及野生型KDML105的种子脱壳并用杀菌剂灭菌70%（v/v）乙醇浸泡2分钟，然后用5%（m/v）次氯酸钠浸泡20分钟。种子用无菌水冲洗三次，并在含有0.8%（m/v）琼脂的营养肉汤培养基（NB）中发芽（Li等人，1993），温度为25-28℃，光周期为16小时，辐照度为200mu;mol m-2 s-1。7天后，将发芽的种子转移到Limpinuntana的营养液中，并在以下条件下生长

上述条件持续14天。将三周龄的幼苗暴露在添加0、50、100或150 mM NaCl的营养溶液中3天。盐胁迫3天后，收获叶片，随机选择，并在60°C下烘干72小时，以测定干质量。按照Beadle（1993）的方法确定相对生长率（RGR），并使用以下等式从NaCl处理开始到结束的干质量增加计算相对生长率：RGR=（lnMf-lnMi）/（tf-ti），其中M是茎或根干质量，t是时间，下标f、i表示初始（第0天）和最终采样（第3天）。

Na 、K 、Ca2 含量：叶片（0.02 g）在60°C的电炉中干燥3天。干燥样品在0.5 M HNO3（65%，v/v）中均质，并在正常条件下静置2 天。然后，将样品在80°C下在电炉中培养1 h。用原子吸收法测定钠离子、钾离子和钙离子的含量分光光度计（AA280FS，安捷伦科技，美国），根据Munns等人（2010）的方法。

过氧化氢含量通过Jana和Choudhuri（1981）的改进方法测量。用液氮均质100 mg叶片组织，然后在3 cm3 50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7）中研磨提取过氧化氢。将匀浆过滤并离心（6000 g，4℃，25 min），并将0.9 cm3的上清液与0.3 cm3的1%（v/v）TiCl4在浓溶液中混合。在盐酸条件下进行离心（6000g，4℃，15分钟）。在410 nm处测量黄色上清液的吸光度。使用不同已知浓度过氧化氢绘制的标准曲线计算过氧化氢含量。

MDA（丙二醛）含量：根据De Vos等人（1989年）的说法，通过测量脂质过氧化分解产物丙二醛（MDA）的形成来估计脂质过氧化。叶片（0.1g）通过搅拌磨机（MM400，德国雷茨）以35Hz/min的频率研磨成细粉两次。然后，添加1cm3的0.1%三氯乙酸（TCA），并离心混合物（5000 g，25°C，15分钟）。离心后，将0.3 cm3的上清液与0.75 cm3的0.25%2-硫代巴比妥酸（TBA）在10%TCA中混合。在532和600 nm处测量所得上清液的吸光度。通过使用155mm-1cm-1的吸光度系数从532nm处的吸光度减去600 nm处上清液的吸光度来测定MDA含量。

膜透性（电解质渗漏）：在施加盐胁迫3天后收获叶片，并将其切成1厘米的片段。将叶段置于试管中5 cm3去离子水中，以去除叶表面的溶质。然后将样品浸入试管中5cm3去离子水中2h，在121°C高压灭菌20min前后测量电导率（EC）。细胞膜稳定性[%]计算为100-[（EC1/EC2）times;100]，式中，EC1是在去离子水中浸泡2小时后的导电性，EC2是高压灭菌20分钟后的导电性。

相对含水量：从每个处理中随机选择植株，并遵循Barrs和Whetherley（1962）描述的方法。将约0.1g叶片样品切成小块，称重以确定初始质量（Mi）。然后将叶片样品在新鲜去离子水中漂浮12小时，然后称重以确定完全水饱和质量（Mf）。样品在60℃烘箱干燥3天，获得干质量（Md）。RWC[%]被确定为[（Mi-Md）/（Mf-Md）]times;100。

光合色素：在2 cm3 N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中提取叶绿素和类胡萝卜素，方法是在MM400搅拌机中以35 Hz/min的频率研磨0.05 g大米叶片两次。将匀浆离心（15 000 g，10 min，4°C），并在461、625和664 nm处测量所得上清液的吸光度。总叶绿素和类胡萝卜素含量根据Arnon（1949）的修正方法计算。

DPPH自由基清除活性：将叶片（0.1g）通过混合磨机MM400研磨成细粉。然后，添加1.0 cm3无水甲醇，并通过Centrivap（加拿大Labconco）浓缩器蒸发。将0.5 cm3样品、3 cm3无水乙醇和0.3 cm3 0.5 mM DPPH自由基溶液混合在乙醇溶液中，使样品与乙醇溶液中的1,1-二苯基-2-苦味酸（DPPH）反应。反应30分钟后，在517 nm处读取颜色变化（从深紫色到浅黄色）。乙醇和样品（不含DPPH自由基溶液）的混合物作为空白。对照溶液由乙醇和DPPH自由基溶液混合制备。清除活性百分比AA[%]计算为[（Acontrol-Asample）/Acontrol]times; 100根据Brand Williams等人（1995年）的说法。

酶提取和分析：将叶片样品（0.5 g）在液氮中冷冻，然后用5 cm3的冷提取缓冲液[0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.5），含有0.5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）和5 mM二硫苏糖醇]研磨来制备用于评估SOD、CAT、APX和GR活性的酶提取物，但在测定APX活性的情况下，需将5 mM抗坏血酸添加到提取缓冲液中。在收集上清液作为酶提取物之前，对匀浆进行过滤和离心（15000 g，4°C，20分钟）。如前所述，对SOD、CAT、APX和GR的活性进行了分析。根据Bradford（1976）的方法，以牛血清白蛋白为标准测定酶提取物中的蛋白质含量。

统计分析：所有分析都是完全随机的，每个处理有五到十个重复。使用单因素方差分析进行统计分析，并使用邓肯检验在Plt;0.05时比较平均值之间的差异。

3结果与讨论

在150 mM NaCl胁迫3 d后，3个独立的过表达OsCaM1-1转基因系、对照转基因水稻系（含来自pCAMBIA1301的T-DNA）和野生型（WT）植株叶片中的Na 含量显著增加。然而，没有观察到K 含量的显著差异，而对照组和WT组的Ca2 含量显著降低。众所周知，K 是维持渗透平衡所必需的，可影响气孔的开放和关闭，也是许多酶的必要辅助因子。Ca2 是植物耐盐性的一个重要决定因素，在非生物胁迫下对植物具有保护作用，在维持植物细胞膜的结构和功能完整性、调节离子转运以及作为胁迫信号传递的第二信使中起着至关重要的作用。在本研究中，对照组和WT组叶片在盐胁迫下Na/K和Na/Ca比值的增加显著高于3个转基因系（图1A，B）。众所周知，高Na 含量对细胞代谢有毒害作用，因此会产生活性氧，并对某些酶的功能造成有害影响。有报导指出，植物中的Na 与Ca2 竞争，通过通道进入细胞，，导致胁迫下Na/Ca比率增加，这与我们的研究一致。与转基因水稻类似，耐盐芦荟保持明显较低的Na/Ca比率，膜损伤较小。

所有3个转基因系、对照和WT叶片中的H2O2含量均增加，并在3d后达到最大值（数据未显示）。所有植株中的H2O2含量均随浓度增加而增加，在150 mM NaCl下达到最大值，但在200 mM NaCl下迅速降低（数据未显示）。这些结果表明，暴露时间和NaCl浓度是影响水稻氧化胁迫的重要因素。在随后的实验中，所有参数在暴露于150 mM NaCl3天后进行检查。所有转基因品系的H2O2含量均低于对照品系和野生型品系（图1C）。脂质过氧化对细胞膜的损害可以通过MDA的积累来指示。在这里，所有植物中的MDA含量在150 mM NaCl下都有所增加（图1D），这与之前关于棉花和烟草的报道一致。然而，与对照和WT相比，转基因植物中MDA的增加不太明显。在许多报告中，盐胁迫下植物中活性氧的产生增多，活性氧介导的膜损伤是植物中NaCl毒性的主要原因，如水稻、番茄、柑橘、和棉花。盐胁迫导致离子泄漏，表明膜受到损伤，这可能受到活性氧增强的膜脂氧化的影响。细胞膜损伤的程度可以很容易地通过测量细胞的电解质泄漏情况来估计。细胞膜是考量许多植物受胁迫的首要指标之一，许多报告表明，

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