茶树叶绿体谷氨酰胺合成酶基因（CsGS2）的分离与鉴定外文翻译资料

 2023-04-05 08:04

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茶树叶绿体谷氨酰胺合成酶基因（CsGS2）的分离与鉴定

摘 要

茶树是一种喜铵植物。然而，人们对这种偏好背后的机制知之甚少。本文从茶树品种“龙井43”分离到了叶绿体谷氨酰胺合成酶基因（CsGS2）该基因对氮同化至关重要。CsGS2的全长cDNA为1622 bp，有一个1299 bp的开放阅读框，编码一个432个氨基酸。同源性搜索和序列分析表明，CsGS2蛋白具有典型GS2结构域的基本特征，与其他植物的GS2具有较高的同源性。亚细胞定位和免疫定位表明CsGS2定位于叶绿体。qRT-PCR和Western blot分析表明，CsGS2表达具有叶片特异性，CsGS2及其蛋白在成熟叶片中表达最为丰富。CsGS2的时间表达模式在对铵态氮和硝酸盐营养的反应中显示出微小的差异。在新梢发育过程中，成熟叶片中CsGS2的转录水平被显著诱导，而黑暗显著抑制了这种诱导。这些结果表明，CsGS2在茶树不同氮形态的差异利用机制中不起作用，并暗示在新梢发育过程中，成熟叶片中存在光依赖性转录调控。

  1. 介绍

氮（N）不仅组成氨基酸、蛋白质、核酸和其他含氮物质在内的化合物（Bloom，2015），还对关键的代谢和发育途径（如植物中的氨基酸和碳代谢）产生强烈的调节作用（Crawford and Forde，2002）。植物主要通过谷氨酰胺/谷氨酸（GS/GOGAT）途径吸收（Cruz等人，2006）吸收铵（NH4 ）和硝酸盐（NO3minus; ) 这两种主要无机形式的氮（Krapp等人，2014）。谷氨酰胺合成酶（GS；EC 6.3.1.2）是驱动植物将无机氮转化为有机氮这一重要途径（Bernard和Habash，2009）的关键酶。在这个反应过程中，N会被并入氨基酸和其他含N的次级代谢物中。因此，GS在植物氮利用的复杂机制中起着关键作用。

在植物中，GS通常以两种主要形式出现，一种存在于细胞质（细胞质GS，GS1）中，另一种存在于叶绿体（叶绿体GS，GS2）（Miflin和Habash，2002；Weber和Flugge，2002；Thomsen等人，2014）。GS1和GS2通常表现出组织或细胞特异性，它们的功能在氮同化中可能会有很大差异。GS1亚型在根器官的初级N同化（Yamaya和Kusano，2014）和叶片衰老过程中氨基酸分解代谢产生的铵的再同化（Masclaux等人，2000年；Thomsen等人，2014年）中发挥作用，而GS2亚型主要促进从NO3minus;中还原的NH4 的同化以及叶肉组织中光呼吸氨的再同化（Seabra等人，2010；Perez Delgado等人，2015）。另外，GS2作为叶肉中主要GS亚型可以保护叶片免受潜在的过量氨毒性（Masclaux等人，2000；Seabra等人，2010）。

开展的许多研究已经确定了GS在氮同化中的作用。迄今为止，已经发现了不同类型的GS1，并对其开展了许多研究，目的是通过GS1基因的过度表达来提高氮利用效率（NUE）（Kazuhiro等人，2013；Yamaya和Kusano，2014；Guan等人，2015，2016；Moison等人，2018）。然而，我们对GS2的了解仍然有限，因为对GS2的研究远远少于GS1。近年来，已从一些植物物种中分离出几个GS2基因，例如苜蓿（Seabra 等人，2010）、水稻（Bao 等人，2015）、小麦（Bernard 等人，2008）和甜瓜（Deng 等人，2010）。此外，一些研究表明GS2在光呼吸氨再同化和对非生物胁迫的反应中起重要作用。例如，在GS2过表达的转基因水稻中观察到，转基因水稻对盐胁迫的耐受性增强和光呼吸能力提升（Hoshida等人，2000）。模型豆科植物日本荷花中GS2的缺失影响了该植物脯氨酸生物合成和酚类代谢（Diaz等人，2010；Garcia Calderon等人，2015）。GS2过表达的转基因烟草幼苗表现出较高的植物生长率（Migge等人，2000）。在拟南芥中过度表达DvGS2提高了植物生物量（Zhu等人，2014），最近，在转基因冬小麦中表达TaGS2增加了转基因冬小麦的氮代谢率和粮食产量（Hu等人，2018）。这些研究都表明，在全球范围内，利用GS2基因可以提高植物的氮素利用水平。在土壤中，植物可获得各种无机氮，不同植物物种对不同氮形态的利用过程背后的机制也不同（Andrews等人，2013）。氮素形式影响氮素的同化过程，尤其是GS的表达和活性，对拟南芥、紫花苜蓿和其他植物进行了相关GS研究（Guan等人，2015；Krapp等人，2014；Yamaya和Kusano，2014）。

茶树（Camellia sinensis）是一种重要的饮料作物，其叶片通常用于制茶。茶树比其他植物需要更多的氮，通常每年需要300-450千克/公顷的纯氮来满足茶树的正常氮需求（Ma等人，2019）。在茶树中，尤其是在其幼芽中，氮含量影响茶叶的产量和质量（Okano等人，1997；Ruan等人，2007b）。茶树也是一种喜铵的植物，研究表明，茶树很好地适应富含NH4 的条件，比NO3minus;能够更高程度地吸收NH4 （Ruan等人，2016；Yang等人，2013）。对茶树氮素利用过程的研究相对有限，主要是研究在NH4 和NO3-处理下，NH4 转运蛋白的不同吸收率（Ruan等人，2016）（Zhang等人，2018）。但对茶树氮同化过程中GS的研究相对较少。Chen等人（2017）发现，GS活性可以作为选择和培育新的高效氮利用率茶叶基因型的指标。在几个水培和盆栽试验中，当茶树被不同的无机氮形式处理时，GS活性不同（Du等人，2015年；Ruan等人，2007a）。这些研究表明，GS可能在茶树的氮素同化中起着重要作用。

从茶叶中分离GS等基因的研究很少。Tanaka和Taniguchi从Sayamakaori茶树品种（NCBI数据库，国家生物技术信息中心）分离出CsGS1；1（NCBI加入，AB115183.1），CsGS1；2（AB115184.1）和CsGS1；3（AB117934.1）。Rana等人（2008，2010）克隆了一个CsGS1基因，并分析了其在脱落酸、水杨酸、过氧化氢、镉和盐胁迫条件下的表达，发现在植物发育阶段和氮利用期间，CsGS1在转录水平上受到调控。在我们之前的研究中，我们已经获得了三个CsGS1s同基因，CsGS1.1（KY649469），CsGS1.2（KY649470）和CsGS1.3（KY649471）（Tang等人，2018）。然而，据我们所知，尚未有报道在茶树中发现或描述CsGS2。

为了全面研究GS在茶树中的功能，我们从茶树品种“龙井43”中分离到一种新的CsGS2。

并对CsGS2在转录和翻译水平上检测了其组织特异性，以及亚细胞定位和细胞特异性定位。还研究了其在不同氮形态和光/暗条件下CsGS2的表达模式。我们的结果表明，CsGS2定位于叶绿体中，与不同的N形式处理相比，光/暗处理对CsGS2的影响更强。

  1. 材料和方法

2.1 植物生长与实验处理

一年生的茶树插条（“龙井43”）首先在蒸馏水中水培一周，然后在1/16浓度的营养液中培养三周。此后，营养液的浓度增加到1/8，茶树在该溶液中培养3周，然后再吸收铵和硝酸盐。1/8浓度的营养液含有以下大量营养素（mmol/L）：（NH4）2SO4（0.125）、Ca（NO3）2（0.0625）、KH2PO4（0.0125）、K2SO4（0.0625）、MgSO4（0.05）、CaCl2（0.0375）和微量营养素（mu;mol/L）：H3BO3（1.25）、MnSO4（0.1875）、ZnSO4（0.125）、CuSO4（0.025）、NH4）6Mo7O24（0.0088）和Fe-EDTA（0.7875）（Ruan等人，2007；a Liu等人2007）。每周更换所有营养液，并用1.0 mmol/L NaOH或1.0 mmol/L H2SO4将其pH调节至5.0plusmn;0.2。植物生长在环境控制的生长室中。光照强度为200mu;mol mminus; 2sminus; 1.空气温度和相对湿度保持在25℃和70%；日/暗光周期为14h/10h。最后，将茶树插条转移到含有3 mmol/L NH4 （1.5 mmol/L（NH4）2SO4）或3 mmol/L NO3minus; 的营养溶液中（3 mmol/L KNO3）作为唯一的氮源，在0、2、4、6、8、10、12和24小时内，其他成分与1/8营养液相同。在每个时间点，使用三个花盆，每个花盆包含8株植物。采样时，从同一盆的8株植物中采集新膨化的茶叶和吸收根，并分别混合作为一个生物复制的样本池。采集样本并在液态氮中快速冷冻，然后储存在minus;80℃超级冰箱中。

光/暗实验在中国农业科学院茶叶研究所拥有的茶园进行，茶园位于中国浙江省嵊州县。在新梢发芽前（2019年3月1日），在茶园中选择一排（12米长）茶树进行本试验。首先，选择枝条最上面的成熟叶片（一片叶片代表一片枝条）并用红色标签标记，总共标记300片成熟叶片，叶片随机分布在该行茶树的树冠上。然后，将这些标记的叶片分为两组，每组包含150片叶片，一组覆盖箔（设置为暗处理），另一组未覆盖箔的设置为光处理。采样于2019年3月15日（发芽日期）开始，每隔6天采样一次，直到2019年4月2日，总共进行了四次采样。在四次采样中，12米长的一排被平均分为四部分。在每个取样时间（上午10:00至11:00之间进行），从同一部位收集覆盖或不覆盖箔的叶片，10片叶片被视为一个生物重复，包括三个重复。取样后，立即将样品冷冻在液氮中，并储存在minus;80℃超冰箱中用于分析CsGS2的表达。

2.2 CsGS2全长cDNA及其基因组序列的克隆

CsGS2 cDNA的全长通过使用SMARTtrade; RACE-cDNA扩增试剂盒，利用cDNA末端快速扩增（RACE）方法扩增。基因特异性引物（5′RACE:5′-CTCTCTAAGTTGGTTTTGGACCCTT-3′；3′RACE:5′-GGTCCAGACCCGTTTGGGGGATTCTT-3′）是根据之前确定的单基因序列设计的（Liu等人，2017a）。回收扩增的cDNA片段，克隆到pMD18-T载体中，并最终测序。

为了分离CsGS2基因组序列，使用DNA提取试剂盒从“龙井43”茶树品种的叶组织中提取DNA。使用的引物为（正向：5′-CTCTAAGTTGGTG-3′；反向：5′-GGTCCAGAGACCCGTTT-3′）。扩增的PCR产物被克隆到pMD18-T载体中并测序。

2.3 CsGS2的生物信息学分析

使用开放阅读框（ORF）Finder确定CsGS2编码氨基酸序列的长度信息(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)。使用ProtParam工具预测了CsGS2蛋白的分子量（Mw）、理论等电点（pI）和不稳定性系数(http://web.expasy.org/protpram）。使用prosite服务器预测CsGS2蛋白的保守结构域(https://prosite.expasy.org)和SMART服务器(http://smart.embl-heidelberg.de/)。为了预测转运肽序列，使用了TargetP 1.1服务器内的ChloroP。

获得的全长cDNA序列用于通过BLASTX在NCBI中搜索同源序列（http://www.ncbi.nlm.nih.）从GeneBank数据库中检索到了其他植物的GS2蛋白序列。然后使用ClustalX程序（Thompson等人，1997）进行多序列比对，并使用Genedoc程序以图形方式比较结果。使用 neighbor-joining方法，用MEGA 5.0程序构建了一个系统发育关系树，n=1000个引导复制（Tamura等人，2007）。用Spidey软件分析CsGS2基因的基因组序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/spidey/).

2.4 CsGS2的亚细胞定位

利用引物（正向：5′-TCCCCGGGATGGCACAGATTGGCTCCTTC-3′；反向：5′-GCTCTAGAGACATGCCAGTTCTGAGC

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