莲子外果皮和莲房中原花青素的化学组成及其抗肥胖抗氧化作用外文翻译资料

 2023-04-05 08:04

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莲子外果皮和莲房中原花青素的化学组成及其抗肥胖抗氧化作用

摘要

对莲子外果皮（LSE）和莲房（LSP）进行了表征，并在纯化的LSE和LSP提取物中分别鉴定出5种和7种原花色素（PAs）。在高脂肪饮食诱导的肥胖小鼠中，无论每日摄入的食物量如何，从LSE和LSP 纯化的PAs均能显著抑制白色脂肪组织（WAT）的重量增加，并降低WAT细胞大小。LSE或LSP给药可显著降低血清瘦素水平，改善血清和肝脏脂质状况（包括TC、TG、HDL-C、LDL-C水平），增加抗氧化酶活性（SOD、GST）和GSH浓度，抑制肝组织脂质过氧化。源于LSP的 PAs通常比LSE更有效。这两种提取物都能改善肥胖小鼠的肥胖、胰岛素抵抗和氧化损伤问题，表明它们是增值功能性食品和营养成分的良好候选品。

关键词：莲子外果皮；莲房；原花青素；高效液相色谱-串联质谱；抗肥胖

介绍

莲是一种在中国、日本、印度、泰国、韩国、北美和澳大利亚广泛种植的水生植物。莲通常被消耗掉的是它的可食部分包括种子、叶子、雄蕊和根，它们的营养价值已经得到了广泛的研究。但是，在加工过程中，不可食用的部分，如莲子外果皮（LSE）、籽梗和莲房（LSP）会被丢弃。在中国，LSE和LSP常被当作调节免疫、降低血清总胆固醇和甘油三酯含量以及保护肝脏免受损害的传统药物。LSP中含有的原花青素（PAs），具有很好的抗氧化、抗癌、降血脂和改善记忆的作用。最近有报道称LSP PAs可有效对抗衰老和阿尔茨海默病。LSE提取物也被报道在细胞模型中具有抗氧化和抗肥胖作用。

PAs是聚羟基黄烷-3-醇单元的低聚物和聚合物。单体在黄酮醇结构的4-8和4-6位相连，形成聚合度更高的直链或支链。水果和蔬菜的类胡萝卜素具有多种有益健康的活性。杨梅脱糖多糖能有效降低高脂饮食诱导的肥胖大鼠的体重，改善血清TC（总胆固醇）、TG（甘油三酯）、AST（天冬氨酸转氨酶）、ALT（丙氨酸转氨酶）、ALP（碱性磷酸酶）、LDL-C（低密度脂蛋白胆固醇）和HDL-C（高密度脂蛋白-胆固醇）水品，也是许多由肥胖引起的临床疾病的生化标记物。通过抑制碳水化合物和脂肪的消化酶，日本七叶树种皮中的高度聚合的PAs在喂食高脂肪饮食的小鼠中表现出抗肥胖作用。葡萄籽中的PAs也显示出抗肥胖作用，表现为大鼠血浆胆固醇浓度降低、肝脏脂肪变性和腹部脂肪含量降低。葡萄籽中的PAs还可以通过恢复大鼠高脂肪饮食引起的血脂异常并抑制调节脂肪生成的基因和肝脏中的VLDL（极低密度脂蛋白）聚集来抑制肥胖。虽然我们在先前的研究中已经对莲子心中的PAs进行了表征，但尚未对植物化学成分，尤其是来自LSE的PAs进行研究。LSE和LSP的PAs的体内抗肥胖活性也尚不清楚。

因此，本文的目的是:（a）通过HPLC-QTOF-MS2分析LSE和LSP中纯化的PAs的化学特征。（b）评估从LSE和LSP纯化的PAs在C57BL小鼠模型中的体内抗肥胖和抗氧化作用。

材料和方法

植物材料和化学试剂

LSE和LSP均来自中国江西省广昌县。将原料分别冷冻干燥（2XZ-2,Linhai,China），在高速粉碎机（FW80,Shanghai,China)）中粉碎，得到细粉。

抗坏血酸、没食子酸和儿茶素标准品均来自Sigma Chemical Company(St. Louis, MO, USA)。TC、TG、H-DLC、L-DLC、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽转移酶（GST）、还原型谷胱甘肽（GSH）试剂盒均购自Nanjing Jiancheng Biotechnology Company (Nanjing, China)。Folin-Ciocalteau试剂、乙腈和甲酸均来自Merck KGaA（Darmstadt, Germany）。使用Millipore（Bedford, MA, USA）的Milli-Q系统纯化水。

PAs的制备和纯化

用200mL含1g L-1L-抗坏血酸的70%丙酮（v/v）提取LSE或LSP粉末（10g）12h，以避免氧化。将提取物在45℃下真空干燥至约50mL，以除去有机溶剂。然后在氮气流下蒸发水层（DSYVI, Beijing, China）。

将上述干燥提取物重新加入10mL水中，依次用氯仿、乙醚和乙酸乙酯再次提取（每次两次，每次100mL），分别去除样品中的脂质、黄酮和叶绿素。然后将剩余的含有PAs的水相加载到AB-8柱上（干燥后71.574g；phi;1.5cmtimes;35cm），然后通过洗涤纯化，将色谱柱与1000mL水和500mL10%（v/v）丙酮溶于水中，以除去碳水化合物和其他水溶性成分。用500mL70%丙酮洗脱回收吸附的PAs。

纯化PAs的HPLC-QTOF-MS/MS分析

使用Agilent 1260 HPLC系统（Agilent Technologies, Shanghai, China）分析了来自LSE和LSP的PAs。采用ODSC18色谱柱（250times;4.6mm，5 mu;m），25℃，流速0.5 mL min-1，进样量10mu;L，流动相为0.2%甲酸水（A）和100%乙腈（B），45min后梯度洗脱，条件为:0-5min，B 5-8%；5-15min，B 8-13%；15-45min，B 13-25%。后期运行间为5min。使用可变波长UV检测（VWD）在278nm处检测峰。HPLC系统与正交加速四极飞行时间质谱仪（6538 Accurate-Mass QTOF LC/MS system; Agilent Technologies, USA）耦合。正交ESI在负离子/多反应监测（MRM）模式下运行。源参数的最佳值为:毛细管电压， 4.0 kV；干燥气体流量，10.0 L/min；干燥气体温度:350℃；雾化气体压力，40磅/平方英寸。选择去质子化分子离子[M-H]-作为前体离子，并进行MS/MS分析。使用氮气作为碰撞气体，碰撞能量设定为20eV，碎裂电压设定为135 V。使用（ ）-儿茶素定量PAs峰浓度范围为0至0.25mg ml-1的外部标准品校准曲线。

纯化的LSE和LSP提取物的PAs和黄酮含量

PAs的总内容。使用香草醛-硫酸法测定纯化提取物中的总PAs含量。简言之，将稀释样本（0.5mL）、香草醛（2.5mL，30mg mL-1）和硫酸溶液（2.5 mL，30%）混合，并在室温下反应20min，直至吸光度达到500nm,使用分光光度计（722G, Hitachi Instruments Inc., Shanghai, China）。LSE和LSP提取物结果用（ ）-儿茶素当量表示，单位为毫克/毫升。校准曲线的线性范围为0.1至0.5mg mL-1（R2=0.9956）。使用以下公式将总PAs含量转换为PAs的干重:

PAs产量（mg g-1）=（V*rho;*n）/（w*1000）

其中，rho;是来自校准回归方程的PAs浓度（mg mL-1）；v为提取液总体积（mL）；n是稀释因子；w是干燥原料的重量（g）；产量为每克干燥LSE（或LSP）的PAs毫克数。

总黄酮含量。将纯化的提取物或槲皮素标准品（1mL）、5%（w/w）NaNO2（0.7mL）和30%（v/v）乙醇（10mL）混合5min，然后加入10%三氯化铝（w/w，0.7mL），并使之在室温下反应持续6分钟。加入5mL 1 M NaOH终止反应。10分钟后，用30%（v/v）乙醇将反应混合物稀释至25mL，用于进一步测定。使用分光光度计（722G,HitachiInstrumentsInc.,Shanghai,China）在430nm下测量溶液的吸光度。使用槲皮素（0.1-0.5mg ml-1，R2=0.9933）的标准曲线计算出总黄酮含量。LSE和LSP提取物结果以微克每毫升为单位的槲皮素当量表示，结果中的含量也以单位提取物中黄酮含量的百分比表示。

动物试验

动物治疗。70只C57BL/6j小鼠（6周龄，雄性）获自Slac Laboratory Animal Co. Ltd（Hunan, China）。实验前，对小鼠进行驯化，并按商业标准饮食喂养一周。小鼠随机分为7组:（1）正常饮食（ND）、（2）高脂饮食（HFD）、（3）高脂低LSE饮食（HFD LSE 25）、（4）高脂高LSE饮食（HFD LSE 100）、（5）高脂低LSP饮食（HFD LSP 25）、（6）高脂高LSP饮食（HFD LSP 100）、（7）高脂阳性对照饮食（HFD Xuezhikang胶囊（XZK））。ND规定饮食含有50.8%玉米淀粉、24.2%酪蛋白、11.9%蔗糖、5%猪油、4%矿物质混合物、2%维生素混合物、2%明胶和0.1%DL-甲硫氨酸。HFD规定饮食含20%脂肪（猪油）、10%蛋白质、0.15%胆固醇和69.85%ND规定饮食。溶解来自LSE（或LSP）的纯化PAs，在蒸馏水中给药，在HFD LSE（或LSP）25、HFD LSE（或LSP）100组中以25mg Pas kg-1和100 mg Pas kg-1体重（BW）的剂量每天通过管饲给予小鼠60天。每天记录小鼠的食物摄入量，并在整个实验期间每周监测其体重两次。食物效率比（FER）=[体重增加量（g）/消耗的食物（g）]times;100。

对于60kg体重的人，小鼠中100mg Pas kg-1 BW的日剂量估计为每天1.2g LSE或每天0.96g LSP（人等效剂量（mg-1 kg）=动物（mg-1 kg）/Km）。根据我们的初步实验推测，该剂量足以对动物模型产生影响。实验结束时，用2%乙醚麻醉小鼠8秒钟，然后在12小时禁食期后折断脊柱处死小鼠。从腹腔动脉采集血液样本。离心10min（2000 rpm，4℃），分离血清。取出附睾和肾周区域的肝脏和内脏脂肪垫，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，并称重。所有实验均按照中国关于实验动物使用和护理的法律法规进行，并经Experimental Animals Ethics Committee of Nanchang University批准(approval number: SCKY (XIANG) 2013-0004; expiry date: October 11, 2016)。

肝脏和脂肪组织的形态学分析。从小鼠中取出肝脏和附睾白色脂肪组织（WAT）样本并固定过夜。将固定组织包埋在石蜡中，切成3micro;m样本，并用苏木精和曙红（Hamp;E）染色。使用放大倍率为200的光学显微镜（OlympusCX31,Tokyo,Japan）观察染色区域。

生化分析。使用商用诊断试剂盒（Nanjing, China）测定血清TG、TC、LDL-C和HDL-C浓度。致动脉粥样硬化指数（AI）的计算公式为AI=（TC-HDL-C）/HDL-C。使用血糖仪（Accu-Chek, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA）测量血糖水平。胰岛素水平采用Youersheng Biotechnology Co, Ltd(Wuhan, China)的商用试剂盒测定。胰岛素抵抗的稳态指数（HOMA-IR）计算方法为HOMA-IR=[空腹血糖（mmol L-1）times;空腹胰岛素（micro;U mL-1）]/22.5。根据Folch等人的研究提取肝组织。肝指数（TG、C、LDL-C和HDL-C）采用与血清分析相同的试剂盒测定。

血清AST、ALT、ALP活性。根据制造商的说明，使用商业检测试剂盒（Jiancheng Biotechnology, Nanjing, China)）通过测量采集的血清样本中AST、ALT和ALP的酶活性来评估肝损伤程度。

血清瘦素水平。采用小鼠特异性商业ELISA试剂盒（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）测定。通过设置为450nm的微孔板读取器测定光密度（OD）。

抗氧化酶活性。简言之，称取0.1g肝组织，并与10mL提取液（每种酶都有其特定的提取液）混合。在冰浴中分别将每种提取混合物均质化，并离心（8500rpm，4℃，10min）。根据制造商的说明，使用商业试剂盒（Jiancheng Biotechnology, Nanjing, China）对上清液进行了超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）、总谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）检测。

总蛋白测定。肝组织中的蛋白含量也使用商业蛋白检测试剂盒（Beyotime, Haimen, China）测定。以牛血清白蛋白（BSA）为标准品制作标准曲线。

统计分析

所有测定均进行三次。结果用平均SD（标准差）表示。LC-MS数据采用Mass Hunter Acquisition B.03.01，Qualitative Analysis B.03.01和Quantitative Analysis B.03.02采集和分析

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