AidH，来自Ochrobactrum sp.的α/β水解酶折叠家族成员的一种新型N-酰高丝氨酸内酯酶外文翻译资料

 2022-01-28 10:01

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AidH，来自Ochrobactrum sp.的alpha;/beta;水解酶折叠家族成员的一种新型N-酰高丝氨酸内酯酶

摘要

N-酰基高丝氨酸内酯（AHLs）是许多群体感应（QS）系统中的信号分子，调节各种致病细菌与其宿主之间的相互作用。AHLs酶 引起的群体性猝灭在预防和治疗感染方面具有很大的前景，目前已有几种酶被报道。在本研究中，我们报告了一种新的土壤细菌Ochrobactrum sp. strain T63 的AHL降解蛋白的特性。这种被称为AidH的蛋白质与任何已知的AHL降解酶没有相似之处，但与含有alpha;/beta;水解酶折叠的Ochrobactrum anthropi ATCC 49188的水解酶高度同源。通过液相色谱-质谱（MS）分析，我们证明AIDH是一种水解AHL高丝氨酸内酯环酯键的AHL内酯酶。突变分析表明，G-X-NUC-X-G基序或alpha;/beta;水解酶中保守的组氨酸残基对AidH的活性至关重要。此外，AidH的AHL失活活性需要的是Mn2 ，而不是其几个被检测的二价阳离子。我们还发现，AidH能显著减少Pseudomonas fluorescens 2P24的生物膜形成和Pectobacterium carotovorum的致病性，表明这种酶能够通过降解ahls有效地抑制这些细菌中的QS依赖功能。

群体感应（QS）是一种广泛存在的以细胞密度依赖的方式，促进细菌群落中的细胞间通讯、调节其行为的现象。在许多革兰氏阴性细菌中，群落产生并释放一种或多种N-酰高丝氨酸内酯（AHL）衍生物到环境中，在结构上，这些信号化合物共享高丝氨酸内酯环，但在酰基侧链的长度和c3取代方面不同，环境中QS信号分子的浓度随细菌种群密度的增加而增加。在积累到临界阈值浓度后，AHL结合并激活其同源转录调节因子以控制靶基因的表达。

细菌中的QS系统调节了许多生物学功能，包括Pseudomonas aeruginosa和Pectobacterium carotovorum中降解性胞外酶的产生，Vibrio fischeri中的生物发光，Agrobacterium tumefaciens中的质粒转移，Serratia liquefaciens液化中的蜂群运动，P. carotovorum中的抗生素产生。P. aeruginosa和Pseudomonas fluorescens中的胡萝卜素和生物膜形成。其中一些功能是病原菌与其宿主相互作用过程中的关键毒力因子。因此，QS的破坏是干预由这些病原体引起的感染的一种潜在策略，最近的一些研究成功地揭示了几种抑制AHL介导的QS系统的方法。例如，S-腺苷甲硫氨酸（Sam）和5-甲基硫腺苷（MTA）类似物是P. aeruginosa RhlI合成AHL的有效抑制剂，来自Delisea Pulchra的卤代呋喃酮通过促进转录激活物的降解来抑制AHL介导的基因表达。一些天然产物和化学品，如大蒜提取物、4-硝基吡啶-N-氧化物、展青霉素、青霉素酸和N-酰基环戊基酰胺，也抑制了QS系统，但机制不太明确。能够降解AHL的细菌源酶是抑制群体感应的另一种机制。虽然这种酶在许多细菌中被发现，但它们可以分为两个家族：AHL内酯酶和AHL酰化酶。AHL内酯酶家族成员通过水解内酯键使AHL失活。该家族的著名实例包括来自Bacillus sp.的AiiA、来自Arthrobacter sp.的AhlD、来自A. tumefaciens菌株A6的AttM、来自A. tumefaciens 菌株C58的AiiB和来自Rhodococcus erythropolis菌株W2的QsdA。另一方面，AHL酰化酶通过水解酰胺键降解AHL。这一家族的酶以产自Ralstonia sp. 菌株 XJ12B的AiiD、产自P. aeruginosa PAO1的PvdQ、产自Streptomyces sp.的AhlM和产自Comamonas sp.菌株D1的未知蛋白质为代表。最后，Leadbetter和Greenberg先前报道了一种Variovorax paradoxus (VAI-C)菌株能够利用AHL作为唯一的营养来源。由V.Paradoxus VAI-C在AHL代谢产物中发现的高丝氨酸内酯表明，这种细菌产生一种AHL酰化酶，但编码这种酶的基因仍然未知。

据报道，Ochrobactrum sp. A44菌株能够灭活由胡萝卜亚种产生的各种合成AHL分子和由P. carotovorum subsp. Carotovorum产生的AHL，虽然负责降解AHL的基因和相关机制尚不清楚。本文报道了一株革兰氏阴性杆菌ochrobactrum sp.t63的新型alpha;-内酯酶的鉴定和鉴定，并对其在两株植物相关细菌中的群体猝灭活性进行了验证。

材料和方法

细菌菌株、培养基和生长条件。表1列出了本研究中使用的细菌菌株和质粒。从云南省采集的土壤样品中分离到Ochrobactrum sp.T63菌株。在28°C的Luria Bertani（LB）培养基或ABM最小培养基中培养Pectobacterium carotovorum Z3-3菌株（实验室培养基）、Pseudomonas fluorescens 2P24和Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pZLR4)。同样培养Ochrobactrum sp. T63菌株。除非另有规定，大肠杆菌菌株在37°C的LB培养基中生长。必要时，按以下浓度添加抗生素：氨苄西林（50 mu;g/ml）、卡那霉素（50mu;g/ml）、庆大霉素（30mu;g/ml）、四环素（20mu;g/ml）和氯霉素（20mu;g/ml）。

AHL降解菌的筛选。为了分离出能灭活AHLS的菌株，我们从中国不同地理位置采集了土壤样本。对于每个样品，我们将1g土壤样品悬浮在无菌水（10 ml）中，并将连续稀释的溶液喷洒到ABM培养基上。将培养皿在28℃孵育1-2天后，发现培养皿上出现的菌落，获得单个分离的菌落，然后在28℃的2-ml试管中培养20小时，在270mu;l的LB培养基中轻轻摇动。然后将N-（3-氧基辛烷基）-大丝氨酸内酯（OOHL）以10 nM的最终浓度添加到细菌培养物中。在进一步2小时培养后，通过将2mu;l上清液滴入接种有A.tumefaciens菌株NTL4（pzlr4）和40 mu;g/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基-d-半乳吡喃苷（x-g a l）的ABM培养基中，评估细菌培养物中存在的OOHL。将自导体检测板在28℃培养16小时，通过在样品周围形成蓝色区域来测定OOHL的活性。保留能在2小时内显著降低OOHL活性的菌株进行进一步研究。

细菌菌株t63的鉴定。我们通过分析其16S rRNA基因序列，鉴定出表现出Oohl失活表型的细菌株。对于本研究所描述的Ochrobactrum sp.T63，我们用引物63sf（5-tgtcgagccctaac-acatgcaagtc-3）和1494sr（5-tgtcgagycttagcttacga-ctt-3）对其16S rRNA基因进行了扩增（Sali位点加下划线）。克隆到pbluesccript II sk（ ）（stratagene）后，对pcr产物进行测序（Sinogenomax有限公司），并利用国家生物技术信息中心（NCBI）的BLAST程序进行分析。

含有AidH基因的DNA片段的克隆和测序。为了克隆T63菌株中负责AHL失活功能的基因，我们首先用前面描述的方法构建了一个黏粒库，用广谱的宿主范围载体pLAFR5来表示其基因组。利用A.tumefaciens报告系统，采用与鉴定菌株t63相似的方法，筛选出含有单个黏粒克隆的大肠杆菌菌株，以检测其AHL失活特性。采用标准分子技术，用载体pBluescript II SK( )进行亚克隆。

一株t63基因框内缺失突变体的构建。为了建立菌株t63的aidh基因缺失突变体，用聚合酶链反应（PCR）扩增了aidh基因两侧的两个片段。一个是由引物A01 (5rsquo;-CAGGAATTCCGCACCGATCCG-3rsquo;)和A1065 (5rsquo;-ATGGGATCCATCGAATAGCTGCGGTCG-3rsquo;)产生的（Ecori和BamhI位点加下划线），另一个是由引物A1307 (5rsquo;-ATGGATCCTACGCTCGCAGCACCTG-3rsquo;)和A2354 (5rsquo;-ATGAGCTCAGACCCATTGAGAATGTC-3rsquo;)产生的（BamhI和saci位点加下划线）。两个DNA片段经相关限制性酶消化后，与Ecori和saci消化后的自杀性质粒pSR47S (1)连接，产生p47SDelta;AidH.。缺失突变体T63Delta;AidH是根据标准程序用p47SDelta;AidH产生的（详细程序见补充材料）。为了构建一个互补质粒，将含有AIDH基因的2.3kb的HindIII片段插入载体PBBR1MCS-2（27）中以产生PB8C-1（图1）。

图1。AIDH基因位点的物理图。单头箭头代表了携带aidH基因的Ochrobactrum sp.T63染色体区域内基因的位置和方向。将编码AHL失活功能的2.3-kb HindIII片段插入pBluescript II SK( )和pBBR1MCS-2中，分别创建质粒p8C-1和 pB8C-1。材料和方法描述了p47SDelta;AidH基因缺失载体的构建。缩写：E，Ecori；H，HindIII；EV，Ecorv；S，Sali。

AIDH蛋白的表达和纯化。用引物AidH-F (5rsquo;-GACCATATGACAATCAATTATCACGAACTTG-3rsquo;)和AidH-R (5rsquo;-GAGCTCGAGTTGTGTGCAATCGCGGATAAAG-3rsquo;)对aidh基因的预测开放阅读框（orf）进行了扩增（ndei和xhoi位点加下划线）。扩增后的DNA片段用ndei和xhoi消化，插入同样消化的pet-22b（ ）（novagen）中，得到pET-AidH，用于生产his6-aidh。用大肠杆菌BL21（DE3）（Novagen）进行蛋白质表达。为了诱导蛋白表达，将IPTG（异丙基-D-硫半乳糖基）添加到大肠杆菌培养物中，培养物在600 nm（OD600）达到光密度为0.6时，最终浓度为0.8 mM。在28°C下进行诱导8 h。根据制造商说明（Amersham），使用Ni2 -氮基三乙酸（NTA）超流纯化His6-AidH。用200 mM咪唑洗脱后，将含有活性His6-AidH的部分汇集并在tris-cl缓冲液（50 mM Tris-Cl和400 mM NaCl[pH7.0]）中透析，并通过SDS-PAGE评估蛋白质纯度。

定点诱变。为了将特异性突变引入到AIDH基因中，我们首先将预测的ORF克隆到PHSG399（Takara）中，得到p399-AIDH，用于根据Takara-Mutanbest系统的方式对特异性氨基酸进行突变。每一个突变都是通过使用一对包含所需核苷酸变化的引物（表2）的PCR导入p399 aidh的aidh。PCR产物被磷酸化，并与T4-DNA连接酶（Takara）连接。所有突变均经双链DNA测序证实。为了表达突变蛋白，每个突变等位基因以与野生型基因相似的方式插入到表达载体pet-22b（ ）中。

确定AIDH催化机理。为了测定AIDH与AHLS反应产物的化学结构，采用高效液相色谱法（HPLC）和电喷雾电离质谱法（ESI）对N-己酰高丝氨酸内酯（HHL）进行消解，并对所得产物进行了分析。我们将纯化的AIDH（50mu;g）与HHL（1mu;mol）在1 ml反应缓冲液（50 mM Tris-Cl和400 mM NaCl[pH7.0]）中混合。在37℃培养30分钟后，用乙酸乙酯萃取混合物三次，并在旋转蒸发器中蒸发合并的有机相。为了进行高效液相色谱分析，将样品重新溶解在0.1 ml甲醇中，并使用对称C18反相柱（4.6times;150 mm）（安捷伦TC-18）进行分析。用40:60甲醇-水（vol/vol）以0.25 ml/min的流速等比例洗脱分离部分。ESI-MS是使用中国科学院化学研究所的LCMS2010仪器进行的。样品在甲醇中溶解，用负离子电喷雾电离。正己酰-L-高丝氨酸是HHL的乳脂溶出产物，其制备方法如前所述。将hhl（0.2mu;mol）在含有200mu;l二甲基亚砜和200mu;l NaOH（1 M）的溶剂中在37°C下培养30分钟。然后用H3PO4将混合物调节到pH6，用乙酸乙酯萃取3次。将组合的有机部分蒸发至干燥，并在上述条件下用高效液相色谱法纯化产物。

AHL的提取和检测。为了评估AHL的产生，在28℃的LB肉汤中培养过夜，0.5 ml不同时间点的培养基被等量的乙酸乙酯萃取，然后通过真空蒸发使混合物干燥，并在50mu;l甲醇中重新悬浮。将1mu;l样品与0.3ml的AHL生物传感器A.Tumefaciens NTL4（pzlr4）（0.8

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