产后乳腺基质中的FGF配体能在不同方面调控上皮形态的发生外文翻译资料

 2022-01-28 10:01

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FGF ligands of the postnatal mammary stroma regulate distinct aspects of epithelial morphogenesis

产后乳腺基质中的FGF配体能在不同方面调控上皮形态的发生

  1. 摘要

FGF信号通路对于乳腺的发育过程至关重要，然而，在组织中究竟是FGF家族中的哪一个成员对干细胞功能和上皮细胞形态发生起作用目前并不清楚。

在这里，我们使用出生后的器官再生模型，研究证明在小鼠乳腺形态形成过程中存在FGFR2。我们发现基底干细胞的组织再生是一个多步骤的过程，包括管腔分化和随后的上皮分支形成。缺乏FGFR2的基底细胞由于管腔分化失败而没有形成上皮组织。此外，由于缺乏定向迁移，FGFR2缺失的上皮细胞无法进行导管分支的起始和伸长。

我们确定FGF10和FGF2是控制着乳腺导管分支的不同方面的基质受体。FGF10调控分支的起始，这依赖于上皮细胞的定向迁移。相反，FGF2控制导管伸长，这需要细胞增殖和上皮扩张的发生。我们的数据显示，不同的FGF配体调控着上皮细胞行为的不同方面。

  1. 简介

发育生物学中一个突出的问题——不同的信号通路是如何调控器官发育的不同层面。

脊椎动物器官发育的分子基础研究面临着一个挑战: 基因组的多样性的存在(通常在功能上是冗余的)，以及在器官发育的不同阶段对必需基因的需求。小鼠的乳腺是基本发育过程中研究分子基础的强有力模型，包括上皮分化和形态发生(Lu和Werb, 2008)。与后生动物进化相对较晚的出现相一致，乳腺的形成依赖于许多相同的分子：例如，WNT和BMP信号通路的组成部分，以及其他个体发育所必需的主要转录因子(Mikkola和Millar, 2006)。

在乳腺发育生物学中，通过成纤维细胞生长因子(FGFs)的信号通路是另一个重要途径(Dillon et al.，2004)。哺乳动物FGF家族由22个成员组成，其中大多数通过与硫酸肝素低亲和力结合，并且和他们的同源受体FGFR1-4具有很高亲和力(Itoh和Ornitz.2008)。FGFs与其受体的结合导致受体发生二聚、磷酸化，并通过一个或多个下游信号子分支发生激活——包括通过Ras-Raf-MEK和PI3K信号传导(Turner和Grose, 2010)。FGF在乳腺癌和乳腺腺体发育中都发挥作用。当配体或受体过度活跃时，过度的FGF信号会导致乳腺肿瘤的发生(Petersetal.1983;Welmetal.，2002;Xianetal.，2005,2007)。FGFR2等位基因多态性导致的上调与人类乳腺癌有关，这表明FGFR2活性过高在乳腺癌中具有因果关系(Hunter et al.， 2007;Meyer et al.，2008)。相比之下，当去除FGF10或其受体FGFR2而使得FGF信号减少时，会导致胚胎发育过程中不能形成乳腺基板(Mailleux et al. 2002; Kim et al.，2013)。

我们之前的研究已经表明，在产后乳腺发育的过程中，通过条件性的去除FGFR1或FGFR2来减少FGF信号的发生，会严重的影响导管分支的形成(Lu et al ,2008; Parsa et al,2008;Pond et al ,2012)。遗传学镶嵌分析表明，在出生后的分支形成过程中，在和野生型细胞共存时，FGFR2缺失的细胞会被其击败(Lu et al.，2008)。此外，尽管在镶嵌环境中，FGFR2缺失细胞中参与乳腺导管分支网络的形成，但当纯突变细胞群体移植到脂肪垫中时，它们不能再生乳腺。尽管这些研究显示，FGFR2在分枝侵袭前沿促进细胞增殖，但在产后乳腺发育和内环境稳定中，FGFR2的确切功能在很大程度上仍是十分突出的。在这项研究中，我们使用体内和体外模型的结合，来检测FGFR2在小鼠乳腺发育过程中的功能。

  1. 结果
  2. 缺乏FGFR2的乳腺上皮细胞降低了自我更新能力，无法再生腺体

之前的研究表明，FGFR2出现在基底乳腺上皮细胞中，猜测它发挥着调控乳腺干细胞（MECs）的功能。我们通过进行“乳腺细胞形成实验”——测量乳腺干细胞在悬浮状态下形成球体的能力，来检测去除FGFR2后是否会影响到干细胞的自我更新能力 (Moraes et al.，2007)。我们通过使用adenovirus-Cre-GFP来感染FGFR2 / 或者FGFR2fl / fl小鼠中的MECs，使细胞中FGFR2被敲除，从而生成对照组细胞(FGFR2 / )或突变组细胞(FGFR2Delta;/Delta;) (Fig.1A) (Lu et al, 2008)。发现大概有80%的细胞能够被腺病毒成功感染，并表达GFP。免疫杂交显示FGFR2蛋白表达水平在感染24h以后，样本中蛋白表达量明显下降。缺少FGFR2的乳腺上皮细胞在形成乳腺微球的能力下降60%,这暗示着其影响了自我更新能力。

我们还进行了醛脱氢酶(ALDH)测定，醛脱氢酶主要在腔上皮细胞中表达，将无色底物转化为绿色荧光产物(图1D) (Ginestier et al.，2007;Eirew et al，2012)。在matrigel凝胶上培养15天后，ALDH 的祖细胞容易形成空囊，而ALDH -的细胞则没有，这说明MECs形成囊泡的能力来自ALDH 的祖细胞(图1 E - G)。与对照MECs相比，缺失FGFR2的MECs在形成囊泡的效率上略有降低(28.5%)(图1G)。因此，我们可以得出结论，FGFR2的敲除并不能完全抑制乳腺干细胞。

为了直接检测FGFR2在干细胞发育中的功能，我们分离了FGFR2敲除的基底细胞，并对其进行乳腺再生实验（图1H）。为了消除由control组细胞带来污染的可能性——在镶嵌环境中突变细胞更具有竞争优势，我们通过报告等位基因R26Rfl 来标记被beta;-Gal 腺病毒感染的FGFR2fl小鼠的细胞(Soriano,1999)。通过分别从FGFR2 / 、R26Rfl/fl、以及FGFR2 / ，R26Rfl/fl的小鼠中分离MECs，然后通过带有CRE-GFP的腺病毒进行感染，从而产生对照组（FGFR2 / ，R26RDelta;/Delta;）和突变组（FGFR2Delta;/Delta;，R26RDelta;/Delta;）的细胞。感染后的MECs被富集到基底细胞(GFP CD24med CD49fhi)中，将其移植到免疫缺陷裸鼠的透明脂肪垫中(图1H)，发现FGFR2突变的基底细胞无法再生成乳腺树(n=32;图1 J)。

缺乏FGFR2的MECs完全不能再生腺体，这不能用干细胞自我更新能力的降低来解释(图1A - G)。该数据表明，目前还不能确定FGFR2在基底细胞的乳腺再生过程中的作用。

  1. FGFR2在基底干细胞分化成管腔细胞的过程中发挥作用

FGFR2缺失的基底细胞无法再生乳腺，可能是由于上皮细胞的主要组成部分——乳管腔细胞（管腔 cell）不能增殖所致。另外，FGFR2缺失的基底细胞可以产生管腔细胞，但其衍生物可能无法形成分支形态。为了验证这些可能性，我们对体内移植后FGFR2缺失的基底细胞的早期形态学变化进行研究。取10000个来自对照组的基底细胞进行移植，发现最初在2周内开始生长并形成小分枝，3周后分枝进一步细化(图2A,B)。来自缺失FGFR2的基底细胞或对照组的管腔细胞未发现上皮的生长。

与不能再生乳腺的结果相一致，表达K8的对照组(野生型)管腔细胞在移植2周后不能分化为表达k14的基底细胞 (shackleton et al ., 2006; Stingl et al，2006;Van Keymeulen et al，2011)。相比之下, 表达K14的对照组中的基底细胞能够在这个阶段分化成表达K8的管腔细胞。表达K14的基底细胞和表达K8的管腔细胞的双层结构证实了准确的组织结构。然而,在移植来自FGFR2零基底细胞,没有腔的细胞和生长仍然非常小(图2 e‴)。

这些结果表明FGFR2是产生管腔细胞所必需的。为了确定这是由于FGFR2激活了参与管腔分化的基因的表达，还是参与了其他通路，我们使用FGF2处理了经过流式分选后的CD24med CD49fhi的基底细胞，并分析了在管腔细胞和基底细胞分化通路中基因的表达(图2F)。Etv5是FGF信号转导的靶基因，FGF2可以使其表达上调(Zhang et al.， 2009)。Notch信号通路的靶基因促进管腔细胞分化，例如Notch1。(Bouras et al.， 2008)但是在该结果中，除Hes6的表达上调之外，并没有发现其他的靶基因上调， (图2F，数据未显示)。然而，尽管FGF2的处理可以提高K14(又称Krt14)、p63 (Trp63)等基础标志物的表达，但是K8 (Krt8)、K18 (Krt18)、Gata3等管腔标志物的表达降低了。这些研究结果表明，在乳腺干细胞分化成管腔细胞的过程中需要FGFR2。这提供了一种机制来解释FGFR2缺失的基底细胞不能再生成功能性的乳腺。

  1. FGFR2对管腔分化的要求揭示了它在上皮分支中的作用

FGFR2功能可能与乳腺发育的其他方面相同，比如上皮分支。为了验证这一可能性，我们利用了以下观察结果:在正常发育和器官再生过程中，基底细胞和管腔细胞谱系保持分离，只有当管腔细胞在上皮细胞中代表性不足时，才会发生基底细胞向管腔细胞分化(Van Keymeulen et al.，2011)。我们测试了FGFR2的要求是否对腔的分化可以规避共移植 FGFR2Delta;/Delta;腔的细胞与基底细胞。我们首先根据CD24和CD49f染色，确定Adeno- Cre-GFP是否优先感染基底细胞或管腔细胞:在对MECs进行流式细胞术(FACS)之前，先用Adeno- Cre-GFP感染MECs。我们发现未感染的GFP - MECs的底腔比(0.76plusmn;0.34)与之感染GFP MECs组相似(0.79plusmn;0.07;图3 a - c)。这些数据表明Adeno- Cre-GFP并不优先感染基底或腔的细胞，FGFR2Delta;/Delta;基底和腔的细胞将被移植在正常比率在生理条件下观察到的。接下来，我们将分类控制或FGFR2 null mec sinf移植到fat pad so fnue mice。Based on the above结果我们得出结论,FGFR2Delta;/Delta;腔的细胞不太可能不足相比,FGFR2Delta;/Delta;基底细胞,因此FGFR2空细胞能够形成乳腺上皮导管网络如果腔的分化是唯一在乳腺再生过程,需要FGFR2函数。

重组腺从control MECS ready – gave rise衍生到上皮树。然而，那些来自突变的MECs不能形成新的导管网络。FGFR2缺失的乳腺上皮细胞(包括基底细胞和发光细胞)完全不能构建上皮网络，这不能用细胞增殖的减少来解释，而细胞增殖是由FGFR2在末端芽(TEBs)中的调控(Lu等，2008)。相反，数据表明FGFR2在调节乳腺上皮分支方面发挥着额外的作用。为了进一步研究FGFR2在分支中的作用，我们使用了3D培养模型(Ewald et al.， 2008)。GFP-expressing控制(FGFR2 / )和突变(FGFR2Delta;/Delta;)MEC的聚合,嵌入在基底膜基质,包含FGF2在基础培养基和培养。对照MEC聚集物在没有FGF2的情况下仍然不分枝(图4B)，但在有FGF2存在的情况下，5天后形成新生上皮分支，10天后形成完全分枝结构(图3F-H)。令人惊讶的是，FGFR2 null MEC聚合体也能够在相同的条件下分支(图3I-K)。

这些结果表明，FGF2比FGFR2更能诱导体外上皮分支的形成。因此，基质中FGFR2的缺失会导致体内嗜碱性粒细胞的分支的形成。

  1. FGF10是出生后上皮分支形成过程中最主要的基质FGF配体

体内对FGFR2的需求与体外分支之间的差异，可以说明FGF2在正常发育过程中驱动形态发生以外的其他配体。为了验证这种可能性，我们调查了一个微阵列数据库，该数据库比较了5周龄小鼠(即在体内快速分支时)导管上皮或TEB上皮细胞与远端基质之间的基因表达(Kouros Mehrand Werb, 2006)。FGFR2表达导管上皮和TEB上皮(红色，图4a)，但不在基质中。其中FGF10基因在这一发展阶段表达最为丰富，其他基因也有表达。qPCR证实FGF10在产后乳腺导管分支阶段高表达，FGF2、7、9、13、18也有表达(表1)。

因此，我们推断在体外实验中，FGF10对上皮分支的影响可能大于FGF2。令人惊讶的是，当FGF2和FGF10在上述的体外分支实验中被放置并重新检测上皮反应时，FGF10并没有诱导上皮分支，而FGF2却从预期的哺乳动物中触发了强健的上皮分支(图4b - d)。这些数据表明乳腺上皮细胞对FGF2和FGF10的反应不同。

  1. 当FGF10和FGF2从一个

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