壬基酚对雄性生殖的影响：大鼠附睾生化指标和抗氧化酶的分析外文翻译资料

 2022-02-14 08:02

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壬基酚对雄性生殖的影响：大鼠附睾生化指标和抗氧化酶的分析

摘 要

壬基酚（NP）干扰雄性生殖的机制尚未完全阐明。因此，本研究旨在评估NP对男性生殖器官的精子重量特性的影响，并阐明NP对附睾的作用性质机制。成年雄性Wistar大鼠用0、100、200或300mg /kg/天的NP溶解玉米油灌胃，连续30天。对照组的大鼠仅用载体（玉米油）灌胃，体重没有明显变化，而绝对睾丸和附睾重量明显下降。尾状体和帽状体附睾中的精子数量和精子活力显著下降，每日精子产量以剂量相关性的方式显着降低。附睾尾部精子转运时间显著缩短300mg/ kg，而辅助动力装置/附睾体中NP显著降低了200和300 mg/kg。在附睾精子中，血浆低密度脂蛋白显著升高，而血浆睾酮显著降低，与剂量相关，NP降低了顶体完整性。AM和5#39;-脱氢酶活性在碱性磷酸酶相关模式下明显升高。附睾精子中SOD、CAT和GPx的活性显著降低。综上所诉，该研究表明NP治疗会损害精子发生，并对附睾精子、补体、抗氧化平衡产生细胞毒作用，它破坏了促氧化剂和抗氧化剂的平衡，这导致大鼠附睾精子中的氧化应激。此外，精子传输时间的减少可能会影响精子质量和生育能力。

1.介绍

在人类过去的50年中，男性和女性生殖道的发育异常率（Sultan等，2001）的下降和众所周知的区域差异（Orgensen等，2001）、癌症发病率的增加（Jacobsen等，2000）以及发育异常率的增加（Sultan等，2001年）与环境影响有关。胺类化合物（Uguz等，2009）。壬基酚（NP）属于烷基酚类，其降解产物为烷基酚聚氧乙烯酯（APES），这是一类众所周知的环境内分泌干扰物（Raecker等人，2011）。壬基酚聚氧乙烯酯（NPE）是一种非离子表面活性剂，主要用作清洁剂、油漆、除草剂和许多其他合成产品（Gong and Han，2006a、2006b、2006c、2006d）的成分。壬基酚（NP）是NPE的最终代谢产物，且更稳定和持久（Sone等，2004; Rivero等，2008）。随着工业的发展，大量的NP已经分解于水中（Cheng等，2006）。

据报道，NP处理对生殖系统造成了巨大的破坏，包括改变类固醇生成，附睾的结构受到干扰以及附睾内精子数量减少（McClusky等，2007）。许多研究表明，NP暴露会产生氧化应激，增强人体血液中性粒细胞中的活性氧（ROS）的生成（Okai等，2004）。此外，NP给药可提高大鼠附睾精液中的活性氧水平，降低抗氧化酶的活性（Chitra et al.2002），睾丸（Chitra和Mather，2004)和睾丸支持细胞（Gong和Han，2006a、2006b、2006c、2006d）。此外，据报道，NP诱导细胞内Ca2 的稳态受损（Gong等，2009）、内质网应激（Gong等，2009），导致大鼠支持细胞凋亡（Li et al，2010）。然而，NP引起生殖毒性的细胞的生化机制尚未完全阐明（Wu等，2010）。

各种环境污染物可以通过产生活性氧（例如过氧化氢H2O2和超氧阴离子O2来诱导氧化应激。ROS可能引发一系列的反应，来损害并导致细胞成分的死亡（Wang等，2003）。当活性氧过量产生时，活性氧刺激DNA碎裂和与线粒体和质膜过氧化损伤相关的精子功能丧失。此外，富含多不饱和脂肪酸的精子质膜非常容易受到活性氧的攻击。同时，附睾富含抗氧化防御系统，可以保护精子通过头盖到附睾尾区的过程，促进精子的成熟过程（Vernet等，2004）。

众所周知附睾在为精子成熟和精子壁的储存提供微环境中起重要作用(Cornwall，2009; Raymond等，2010）。由附睾上皮细胞合成和分泌的许多蛋白质被认为是附睾微环境的重要成员，并且参与雄性生殖活动.包括精子成熟的启动、精子卵母细胞的识别，直接或间接的顶体反应（Yenuqu等，2006）、与透明带的相互作用，并与卵母细胞的质膜结合并融合（Cuasnicu等，2002）。所有这些修饰都需要一个最短时间的时间才能发生。精子母细胞必须留在附睾帽和人体中的时间（Franca等，2005）。在通过附睾的过程中，作为成熟过程的一部分，精子的许多形态生理学和生物化学特征被修改（Orgebin CNIST，1969）。精子通过附睾的时间在精子的成熟中起重要作用。因此，这个时间的改变可能引起这种成熟的问题，也会改变射精配子的数量（ Klinefelter，2002）。

然而，关于壬基酚对雄性大鼠的生殖器官和生育能力的影响的研究是有限的。此外，NP对附睾作用的性质和机制尚未完全阐明。因此，研究环境雌激素是否会对哺乳动物的精子功能有直接影响是很重要的。本研究旨在评估NP对男性生殖器官重量、精子特征、TIOS的影响，并阐明NP对附睾的作用性质和机理。

2.材料和方法

化学。具有98％分析标准的壬基酚（4-壬基酚）、邻苯三酚、叠氮化钠Alexa Fluor-488-PNA、Rh123和谷胱甘肽还原酶购自美国密苏里州圣路易斯市西格玛奥德里奇化学公司。所有其他化学品均为分析用化学品、动物和治疗用化学品。将成年雄性Wistar大鼠（90天）圈养在干净的聚丙烯笼中，并保持12小时光照、黑暗循环和20-25℃的温度，可随意获取食物和水。在实验前7天，每天处理大鼠5分钟以使它们适应人类接触，并使其对后续处理方案的生理反应最小化（Ma和Lightman，1998）。将以0、100、200或300mg/kg/天NP溶解在玉米油中并通过管饲法给予大鼠连续30天，根据每只大鼠的重量调节灌饲体积。根据以前的出版物选择剂量和持续时间（de Jager等，1999; Hossaini等，2001; Han等，2004a，2004b; Gong和Han，2006a，2006b，2006c，2006d; Baek等，2007; Yon等，2007）。维持对照组动物并单独使用灌胃玉米油载体。在给药和安乐死之前记录体重。

剖检。将动物禁食过夜。在最后一次给药后24小时，将动物称重并在乙醚麻醉下在肝素化管中从眼眶后窦收集血液样品。将样品离心并取上清液尽快将血浆与凝块分离，并储存在-80℃直至分析。对动物实施安乐死，取出睾丸、盖体和附睾尾部，并清除粘附的脂肪和结缔组织。用克记录睾丸和尾部的重量。用附睾帽/体进行精子计数，而来自每只动物的附睾尾部用于精子计数和运动性及生化参数。来自每只大鼠的一只睾丸用于评估每日精子产生（DSP）。

精子数和运动性。解剖Cauda附睾，称重，立即放入5ml生理盐水中切碎，然后在37℃下孵育30分钟以使精子离开附睾小管。使用相差显微镜以400倍的放大率记录运动精子的百分比。通过使用如前所述的Neubauer 血细胞计数器测定总精子数（Yokoi等，2003）。为了确定精子活力， 在3个不同的区域中观察到100个精子，并且分类为运动和非运动精子，并且运动性表示为百分比发生率。将该精子悬浮液的等分试样用于评估精子的顶体完整性，线粒体膜电位（M）和5#39;-核苷酸酶活性，其他样本用于后续生化研究。以相同的方式，用剪刀将附睾的头部/体部分切成碎片，并按照附睾尾部所述计数精子。

每个睾丸的每日精子产生（DSP）和附睾中的精子传输时间。根据先前描述，在成年大鼠中测定每日精子的产生（Blazak等，1993）。将一个睾丸称重，解封，并使用Polytron匀浆器（Sharpe等，1995）在含有0.01％Triton X-100的50ml冰冷的0.9％氯化钠溶液中进行均化处理。使匀浆静置沉降1分钟，然后轻轻混合，将10ml等分试样转移到玻璃小瓶中并储存在冰上。在每个样品充分混合后，在40微米物镜的光学显微镜下测定Neubauer型血细胞计数器的四个室中的精子头数（步骤19精子头），并进行计数。为了计算每日精子产量（DSP），将第19阶段的精子细胞数除以6.1，即精子细胞存在于生精上皮中的精液周期天数。通过附睾/附睾或附睾尾部的精子 通过时间是通过用DSP划分每个区域内的精子数来计算的（Robb等，1978）。

血浆乳酸脱氢酶（LDH）酶和睾酮。如前所述估算血浆乳酸脱氢酶（LDH）酶（Jaiswal等，2005）。使用Pathozyme Testosterone ELISA试剂盒在肝素化血浆中测量睾酮。简而言之，将标准品、标本和对照品分配到适当的孔中，然后使用睾酮HRP试剂和抗睾酮试剂，然后彻底混合并在37℃下孵育90分钟。然后用去离子水和亚硝酸钠冲洗孔并将底物溶液分配到每个孔中，轻轻混合并孵育20分钟。用“终止试剂”终止反应，并在450nm处记录吸光度（Chen等，1991）。

顶体完整性。在用阿列克谢-荧光素-488-PNA （花生凝集素）结合物（分子探针，Eugene，或美国）染色后，使用落射荧光显微术评估精子顶体完整性。Alexa Fluor-488-PNA通过偶联来自大豆的凝集素胰蛋白酶抑制剂（SBTI）和Alexa Fluor-488偶联形成。Fluor-488-PNA在490nm处的激发导致519nm的绿色荧光。凝集素SBTI与顶体酶结合，并且还抑制丝氨酸蛋白酶的催化活性。简而言之，将来自每个处理的精子样品涂在显微镜载玻片上并风干。样品是用99％甲醇固定并保持在室温下直至染色。为了染色，将载玻片与10mu;g/ml Alexa Fluor-488-PNA在37℃温育30分钟，用PBS洗涤，然后使用适当的过滤器在荧光显微镜（Zeiss，Axiophot，Germany）下进行分析。在每次重复中，计数约100个精子以确定具有完整顶体的精子的比例。虽然在顶体区域中显示强烈和中等亮度荧光的精子被认为是完整的顶体，但在顶体区域中显示弱、斑驳或无荧光的精子被认为是受损的顶体。在每次重复中，计数约100个精子以确定具有完整顶体的精子的比例（Varisli等，2009）。

线粒体膜电位（Delta;psi;m）。使用荧光染料罗丹明123（Rh123）测量用壬基酚处理后精子的Delta;psi;m，荧光染料罗丹明123是一种细胞渗透性阳离子的染料，它可以基于高度负Delta;psi;m积聚在通电的线粒体中（Hong和Liu，2004）。Delta;psi;m的去极化导致Rh123从线粒体中泄漏，并且细胞内荧光减少。将不同组中的精子样品稀释（-50times;106 精子/ ml），并将300mu;l稀释的样品在37℃黑暗中装入10mu;M的Rh123中30分钟。在加载Rh123后，洗涤精子样品并使用分光荧光计评估荧光强度，激发波长为488nm，发射波长为530nm。Delta;psi;m表示为Rh123的荧光强度。

5#39;-核苷酸酶测定。根据Heppel和Hilmoe（1955）的方法测量5#39;-单磷酸腺苷中无机磷酸盐的释放速率，同时对底物浓度进行微小改变（Chakrabarti等，2003），测定5#39;-核苷酸酶的活性。简而言之，通过在37℃下以3000g离心收集对照组和壬基酚处理的大鼠精子颗粒沉淀（2000万精子/ml），在0.9％盐水中洗涤两次，并悬浮在0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液中（pH 8.5），每个反应管中含有3mmol/L cAMP和50mmol/L MgCl2溶解在0.1mol/L Tris-HCl缓冲液。将试管在37℃下培养30分钟，然后加入0.5ml 20％三氯乙酸终止反应。然后将混合物在4℃下以10000g离心。评估上清液的磷酸盐估计（Chen等，1956）。因为5#39;-核苷酸酶的活性与吸光度成正比，所以比较活性用820nm处的吸光度表示。

生化分析。将附睾尾部精子悬浮液在4℃下以800times;g离心10分钟，并将沉淀重悬于0.01M Tris-HCl缓冲液（pH7.4）中。在玻璃特氟隆均化器的帮助下将精子悬浮液均质化，并且适当地处理匀浆的等分试样以评估以下生化参数。使用BCA试剂盒（Pierce，Rockford，USA）测定蛋白质浓度，该试剂盒使用牛血清白蛋白作为标准。

生成过氧化氢。通过Pick和Keisari（1981）的方法测定过氧化氢的产生。简言之，培养混合物含有1.641ml磷酸盐缓冲液（50mM，pH 7.6），54mu;l辣根过氧化物酶（8.5单位/ml），30mu;l0.28nM酚红，165mu;l5.5nM右旋糖和600mu;l酶源，在35℃下静置30分钟，加入60mu;l10N氢氧化钠终止反应。在标准波长分光光度计上相对于试剂空白在610nm处读取吸光度。对于标准曲线，将已知量的过氧化氢和除酶源之外的所有上述试剂在35℃培养30分钟，然后加入60mu;l的10N氢氧化钠，并在610nm处读取光密度。产生的H2O2的量表示为在35℃下产生的H2O2 / min / mg蛋白质的nmol。

脂质过氧化（LPO）。丙二醛（MDA）作为脂质过氧化的最终产物形成，是氧化应激强度的指标。MDA与硫代巴比妥酸反应生成一种有色产物，可在532nm下进行光学测量。通过Buege和Aust（1976）的方法测量LPO、硫代巴比妥酸反应性物质的分解产物。简而言之，储备溶液含有等体积的在0.25N HCl中的15％（w / v）三氯乙酸和在0.25N HCl中的0.37％（w / v）的2-硫代巴比妥酸。将一体积的测试样品（精子悬浮液）和两个体积的储备试剂在螺旋盖的离心管中混合，涡旋并在沸水浴上加热15分钟。在冰上冷却后，通过在1000g离心15分钟除去沉淀物，并在532nm下测量上清液对含有除测试样品外的所有试剂的空白的吸光度。该值表示为每mg蛋白质形成的丙二醛当量的mu;mol/ min。

酶抗氧化剂的评价。通过Marklund和Ma

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