纤维素酶中添加膨胀素可以提高生物乙醇的产量外文翻译资料

 2022-02-14 08:02

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纤维素酶中添加膨胀素可以提高生物乙醇的产量

关键词:纤维素酶

棒曲霉素

朗缪尔等温线(Ln (DPA) 3) 3minus;

发酵生物乙醇

在CMC琼脂平板上显示清晰带的一个基因组克隆(puc189)与糖基水解酶(GH)家族12内葡聚糖酶具有同源性。纯化重组纤维素酶(C18)对CMC的活性最高，其次为Avicel PH101和废纸，经色谱分析证实。研究了膨胀素(E11CB)对废纸活性的影响。纯化后的E11CB与废纸结合的朗缪尔等温线拟合良好(R2 = 0.97)。利用[Ln(DPA)3]3minus;复合物的紫外荧光原位检测与废纸结合的重组E11CB蛋白。扫描电镜证实，E11CB结合使光滑的微纤维转变为粗糙的非晶表面。在低纤维素酶负荷下，用纯化的E11CB处理纯纤维素和木质纤维素，观察其酶解性能的改善。以废纤维素纸的酶解产物为底物，利用酿酒酵母生产生物乙醇。

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1. 介绍

世界范围内每年产生数十亿吨有机废物，它们是农业活动、工业食品加工和城市固体废物[1]的残留物。纤维素是这类废弃物的主要成分，按干重计算约占40-50%，可用于平台化学品和燃料的可持续生产[2,3]。这一过程的主要限制之一是，将纤维素转化为可发酵糖[4]所需的酶的成本始终很高。除酶相关因素外，纤维素的聚合度、可达性和临界粘度进一步降低水解速率[5,6]。虽然这些因素的贡献是有争议的，但纤维素的可接近表面积(颗粒大小和孔隙度)已被认为是影响木质纤维素基质[7]酶解速度和程度的最重要因素之一。一般认为纤维素酶在水解前需要吸附在不溶性纤维素的表面，从而松开难以接近的紧密包裹区域，暴露埋在微纤丝[8]内的纤维素链。许多纤维素酶是模块化蛋白质，至少有两个不同的模块:催化模块和碳水化合物结合域(CBD)，通过连接序列相互连接。人们认为a

lowast;通讯作者。

电子邮件地址:kumarmohit@yahoo.com (M. Kumar)。http://dx.doi.org/10.1016/j.procbio.2016.09.012

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纤维素酶中的CBD通过增加不溶性底物表面的局部酶浓度来增强催化域的水解活性[9-11]。缺乏CBDs的催化核心结构域与纤维素结合的亲和性较低[12-14]。CBDs在没有显示任何可检测到的水解活性[15]的情况下，从物理上破坏了纤维纤维素网络的结构。近年来，很少有细菌(膨胀性蛋白)和真菌(swollenin)蛋白被发现具有与CBDs类似的功能[7,10]。

本研究以废纤维素纸为原料，研究了纤维素酶与膨胀素的协同作用，制备生物乙醇。

2. 材料和方法

纸张(BILT Copy Power, BILT India)被用作纤维素废纸。按照厂家的定义，废纸的特性为:80GSM，亮度(93% Elerpho)，硬度(2.6机向，1.6跨机向)。所用试剂均为分析级试剂，均购自印度HiMedia、Thermo Scientific、India和Sigma-Aldrich公司。

2.1元基因组文库的构建

土壤样本按照前面描述的[16]采集。根据库马尔和肯纳[17]提取土壤元基因组DNA。半基因组DNA (5 g)经0.5 U部分消化。

限制性内切酶BamH1 (Thermo Scientific, India)。3 - 8kb片段由琼脂糖凝胶(1.2%，w/v)经凝胶萃取试剂盒按照制造商协议(Thermo Scientific, India)洗脱。使用T4 DNA连接酶在8◦C连夜连接插入DNA 100 ng和Bam H1消化去磷酸化pUC19载体300 ng (Thermo Scientific, India)。采用热休克法将结扎液转化为大肠杆菌DH5细胞。对添加CMC(羧甲基纤维素，Sigma，印度)的lb -氨苄西林琼脂平板上的cell -lulase活性进行了扩增和筛选。在37◦C过夜种植转基因作物，随后用革兰氏碘浸泡10分钟，并用多余的蒸馏水冲洗。在暗色背景下，菌落周围有一个清除区，表明纤维素酶活性可以水解CMC。

2.2。膨胀素/膨胀素样蛋白的分子多样性

采用罗瑞亚琼脂连续稀释技术，从农业土壤、受侵染植物叶片、茎干和腐烂番茄中分离到膨胀性基因。按照Kumar等人的描述提取了所有分离株的基因组DNA。PCR扩增采用以下引物:

EXLX-1: 5 - gaaggagataaggatggcatatgacgacctg - catgaa -3 [15]

EXLX-2: 5 - ATGATGGTAATGGTGTTCAGGAAACTGAACATG-GCC-3 [15]

Exp M-2 F: 5 -GGCGGCGCCTTCATGYTNGAYCCNAT-3(本研究)

Exp M-2 R: 5 - gctgggtgcccacgaartrrttrtar -3(本研究)。

PCR反应包括10times;PCR缓冲液、引物各10 pmol、2.0 mM MgCl2、0.2 mM dNTPs、1个单位Taq聚合酶(Life Technologies, India)。放大是热循环(美国应用生物系统公司)与下列条件:初始变性在94◦C 3分钟紧随其后30周期94◦C 1分钟,在52 72◦◦C 0.45分钟和C 1分钟。最后在72◦C扩展做了10分钟。

2.3纤维素酶和膨胀素的序列分析

纤维素酶和扩张素基因的测序在两股(羊膜生物科学，班加罗尔，印度)。利用NCBI的BLASTP程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和CDART程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/lexington/lexington.cgi)分别对推导出的蛋白序列进行序列同源性搜索和保守域分析。ORF是通过NCBI的开放阅读框(open reading frame, ORF)查找工具(http://www.ncbi.nlm.nih)确定的。gov / gorf gorf.html)。利用SignalP 4.1 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)对推导出的氨基酸序列中的假定信号肽序列进行预测。以EXLX1为模型蛋白(PDB Id: 2jeN)[19]，用ESPrit 3.0鉴定了膨胀素(E11CB)的二级蛋白结构。采用可视化软件Dynamics (VMD 1.9.2)[20]对蛋白进行建模。

2.4重组蛋白的表达和纯化

从puc189中提取的纤维素酶基因(C18)，在去除其信号肽序列后，经聚合酶链反应(PCR)从重组质粒中扩增得到，其正向引物为5 - CACCGCTTCGTCATCAAACCCGTCGGA-3，反向引物为5 - ataaaggttaaccctgcattgccggcg -3。扩增的PCR产物按照制造商的说明连接到pET101D表达载体(Life Technologies, India)中，

将重组DNA转化为大肠杆菌BL21 (DE3)。将携带pET101D-C18的大肠杆菌BL21 (DE3)在37◦C条件下，在100 ml LB肉汁中与卡贝尼西林(100 g/ml)共培养至600 nm时细胞光密度达到0.6，加入0.5 mM异丙基d-1-巯基半乳糖苷(IPTG)诱导培养。在25◦C孵育20小时后，使用centrifugation(10000times;g, 20分钟，4◦C)采集细胞，在50毫米磷酸盐缓冲液中复苏(pH 7.0)。复苏细胞使用1times;CelLyticTM B细胞裂解试剂(Sigma, India)裂解，离心30分钟。根据制造商的说明，所得到的上清液由HisPurTM钴净化试剂盒(Thermo Fisher, India)进行纯化，该试剂盒由之前的再悬浮缓冲液平衡。用10mm咪唑在含0.3 M NaCl的50mm磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中洗涤后，用300mm咪唑缓冲液洗脱结合蛋白。同样，在pET101D载体上克隆了sp芽孢杆菌E11CB的expansin基因(E11CB)，并纯化了重组蛋白。

2.5 SDS-PAGE和酶谱分析

采用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对纯化后的C18和E11CB蛋白在变性条件下的分子量和纯度进行了测定。对C18蛋白进行酶谱分析时，将纯化后的蛋白按前面介绍的方法[21]，直接加入含有0.2% CMC的10% PAGE凝胶中进行酶谱分析。

2.6重组纤维素酶(C18)的生化特性研究

C18活动是衡量孵化0.1毫升的2% (w / v) CMC在0.1 M醋酸缓冲(pH值5.0)在最后一卷2毫升。在55°C pre-incubation 5分钟后,酶反应是由添加0.1毫升的适当稀释酶提取(10次)55◦C。二硝基水杨酸试剂的加入终止了反应。将其放入沸水中10分钟，然后放入冰水中冷却。用分光光度计(日立，日本)在540 nm处测定所得颜色的吸光度。用二硝基水杨酸法测定还原糖释放量为葡萄糖。同时进行包含所有试剂的对照，但在添加酶之前终止反应。纤维素酶活性的一个单位被定义为在特定的检测条件下每分钟催化释放1摩尔葡萄糖当量的酶的数量。同样，用Avicel PH101 (Sigma-Aldrich，印度)和废纸进行酶分析。最佳pH值和温度按[23]之前的描述计算。采用硅胶60薄层色谱(Merck, Darmstadt, Germany)[21]对不同纤维素基质水解过程中还原糖的释放进行了分析。

2.7重组膨胀素结合实验(E11CB)

采用5 g/L未经处理的废纸和不同浓度(0.0 ~ 0.2 g/L)纯化的E11CB，在0.1 M乙酸钠缓冲液(pH 5.0)中进行吸附实验。反应混合物以2万g离心5 min，分离未结合蛋白和结合蛋白。用微双缩脲法测定未结合蛋白的含量。将吸附后的E11CB浓度计算为初始(坯料)与初始(坯料)的差值

释放E11CB浓度。利用Langmuir等温线[25]测定吸附等温线参数:

1/A = 1/Amax[1 Kd/E] (1)

式中A为每g纤维素吸附蛋白量(mol/g)， Amax为平衡时每g纤维素最大蛋白吸附量(mol/g)， E为自由蛋白浓度(mol/L)， Kd为解离常数(mol/L)。

2.8废纸上E11CB结合物的原位检测

用E11CB预处理废纸，用蒸馏水冲洗两次，去除未结合蛋白。然后，结合的E11CB被允许优先结合三个二吡啶酸分子(DPA)和一个镧离子(Ln3 )， [Ln(DPA)3]3minus;之间的络合物，通过他的标签E11CB所描述的[26]。凝胶文献(Bio-Rad，印度)记录了结合态Ln离子在紫外光激发下的E11CB敏化发射。

2.9扫描电镜(SEM)分析

扫描电镜(SEM) (Supra 55;以德国蔡司(Zeiss)为研究对象，分析了缓冲液(乙酸盐)、BSA和E11CB处理后废纸的微观结构变化。涂上一层薄薄的金使样品导电。显微镜的加速电压保持在20 - 30kv范围内。

2.10 C18和E11CB之间的协同作用

以醋酸盐缓冲液(0.1 M, pH 5.0)处理废纸(5 mg)为对照。采用0.06和0.12 IU/mg两种不同浓度的C18酶解。还原糖释放量估计如上所述。纤维素转化为葡萄糖的计算公式如下:

葡萄糖转化率(%)=(产生的葡萄糖mg) /

[纤维素中葡萄糖的mgof单位]times;100 (2)

2.11从废纤维素纸中释放还原糖的发酵

手工切割废纸，使其粒径达到0.2-0.3 cm长。酶促反应如上所述。根据Yu和Li[27]的描述，用释放糖作为酿酒酵母菌生产乙醇的底物。发酵效率计算公式如下

发酵效率(%)=(实际乙醇产量/

理论乙醇产量)times;100 (3)

2.12核苷酸序列提交

本研究报告的核苷酸序列保存在GenBank数据库中，加入号为KP876053-55。

图1所示。重组纤维素酶C18蛋白的纯化。Lane M:分子量标记(Bio-Rad，印度);Lane 1:诱导前细胞总提取物;Lane 2:诱导后细胞总提取物;Lane 3:纯化C18蛋白;Lane 4:添加0.2% CMC的聚丙烯酰胺凝胶，经芒果红染色，酶谱分析C18蛋白。

3.结果与讨论

3.1纤维素酶的筛选与生物信息学分析

对基因组文库(每克DNA 5.78times;104个克隆，平均大小为3.5 Kb)进行筛选，得到了一个在CMC琼脂平板上具有纤维素酶活性的克隆(图S1)。克隆序列分析表明，4.2 Kb insert的ORF值为786 bp长(C18)。编码区上游为可能的启动子序列，- 35区为CACTCAT， - 10区为TATAAT，核糖体结合位点(AGGGG)。ORF (C18)编码261个氨基酸残基，预测分子量为28710 Da。观察到28个氨基酸在N末端的信号肽序列。C18的序列相似性分析表明，它与其他几种微生物的内葡聚糖酶蛋白序列具有高度的相似性。与地衣芽孢杆菌GXN151[28]的Cel12A和地衣芽孢杆菌SVD1[29]的GH12A的同源性分别为99%和95%。C18的三维结构表现为-jelly roll褶皱上接枝的开放活动中心沟槽，这与之前报道的[30]吻合较好。与碳水化合物相互作用的H97、D137、M157、G166、W197、E243等氨基酸残基保存在C18中。

3.2纤维素酶的表达

将编码C18的完整基因克隆到pET101-D (pET101-D -C18)中，并在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达。感应后,

3.3纤维素酶的生化特性

在使用不同pH缓冲液的酶测定中

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