古菌毒素-抗毒素RelE-RelB复合物的晶体结构，具有毒素活性和抗毒素作用的影响外文翻译资料

 2022-02-14 09:02

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古菌毒素-抗毒素RelE-RelB复合物的晶体结构，具有毒素活性和抗毒素作用的影响

大肠杆菌染色体编码毒素-抗毒素对。毒素RelE切割位于核糖体中A位点的mRNA，而抗毒素RelB则减轻RelE的作用。超嗜热古菌Pyrococcush orikoshii OT3具有古生物同源物aRelE和aRelB。在这里，我们报告aRelE的复合晶体结构，其中aRelB以2.3 Aring;的分辨率确定aRelE折叠成alpha;/beta;结构，而aRelB缺乏明显的疏水核心并且广泛包裹围绕aRelE的分子表面。两种组分均未显示与已知核糖核酸酶或其抑制剂的结构同源性。定点诱变表明，在C末端区域的Arg85强烈参与aRelE的功能活性，而Arg40，Leu48，Arg58和Arg65在毒素的活性中发挥适度作用。

原核染色体含有毒素-抗毒素基因座，称为“成瘾模块”，它由分别编码稳定毒素和不稳定同源抗毒素的操纵子组成的两个基因组成。在稳定状态下，抗毒素通过直接蛋白质-蛋白质相互作用中和毒素的作用。此外，抗毒素和毒素-抗毒素复合物与它们自己的操纵子内的启动子DNA结合，并负调节它们自身的转录。因此，抗毒素作为操纵子转录的阻遏物起作用，并且毒素充当共抑制剂。在通过环境胁迫（例如氨基酸和碳源限制）诱导后，不稳定的抗毒素被ATP依赖性蛋白酶（Lon）或细菌蛋白酶体系统降解，从而导致由毒素的细胞效应导致的快速生长停滞和细胞死亡。大肠杆菌染色体编码至少五个毒素-抗毒素基因座：relBE，mazEF（chpA），chpB，dinJ-yafQ和yefM-yoeB。relBE和mazEF对已被很好地表征。毒素RelE和MazF是碱性蛋白质（11-12 kDa），而抗毒素RelB和MazE是酸性蛋白质（9 kDa）。relBE和mazEF系统在氨基酸饥饿期间被激活。通过其同源抗毒素的后续表达来逆转由两种毒素的表达引起的集落形成和翻译的抑制。因此，relBE和mazEF系统可能在饥饿或其他类型的应激期间充当生长调节剂，而不一定导致细胞死亡。然而，由于缺乏明显的序列相似性，RelBE和MazEF被分类在不同的家族中。最近报道了RelE以位于核糖体A位点的密码子特异性方式辅助mRNA切割。因此，RelE是核糖体依赖性核糖核酸酶（RNase）并且优先切割终止密码子（UAGgt; UAAgt; UGA）和感知密码子（UCG和CAG）。相比之下，细胞效应MazF的争议很有争议。据报道，MazF切割具有高密码子特异性的mRNA和tmRNA，其以与RelE非常相似的方式位于核糖体A位点。相反，另一项研究发现，MazF作为核糖核酸酶起作用，不依赖于核糖体，并且在功能上与RelE不同。MazF-MazE复合体的晶体结构最近已经以分辨率确定1.7 Aring;。在晶体结构中，MazE和MazF形成由交替的MazE和MazF同源二聚体（MazF2-MazE2-MazF2）组成的2：4异构六聚体。虽然结构显示MazE的C末端区域是非结构化的，在形成的裂缝上延伸在MazF同型二聚体中两个MazF分子之间，但抑制机制仍有待确定。

细菌relBE系统在古生菌中是保守的，例如在Methanococcus jannaschii，Archaeoglobus fulgidus和P. horikoshii OT3中。来自M. jannaschii的Archaeal RelE以与大肠杆菌RelE毒素相似的方式切割翻译核糖体上的mRNA。在我们自己的结构基因组学研究中，关于超嗜热古细菌P. horikoshii OT3，我们分别鉴定了两个基因，即PHS103和PHS104，其具有与来自大肠杆菌的RelB和RelE的序列相似性的翻译产物。因此，他们的翻译产物分别被指定为aRelB和aRelE。为了深入了解细菌relBE系统的结构-功能关系，我们将aRelE与aRelB复合结晶。在这里，我们报告了aRelB-aRelE复合物的晶体结构，分辨率为2.3 Aring;。复合物的组分在结构上与先前描述的RNA酶及其抑制剂无关。Arg40，Leu48，Arg58，Arg65和Arg85似乎是aRelE功能活性的必需氨基酸，如通过定点诱变所确定的。

结果

结构确定

在P. horikoshii基因PHS104编码aRelE，而PHS103编码aRelB。通过测量其对大肠杆菌细胞的集落形成单位的影响来检查PHS103和PHS104的基因产物抑制蛋白质合成的可能性。aRelB和aRelE由67和90个氨基酸组成，计算的等电点分别为3.83和10.87。因为没有aRelB-aRelE复合物的晶体生长，所以使用胰凝乳蛋白酶将酶消化，酶与室温下的比例为1：100，持续1小时。N末端测序和MALDI-TOF质谱分析表明，胰凝乳蛋白酶在aRelE的C末端的酪氨酸和赖氨酸之间的单个肽键处特异性切割，导致His-标签序列和C-末端赖氨酸的缺失（来自aRelE的Lys90）。如方法中所述，然后可以使如此制备的aRelB-aRelE复合物结晶。制备用于aRelB-aRelE的硒-甲硫氨酸（SeMet）衍生物，并以与天然aRelB-aRelE所述相同的方式进行消化。

通过MAD将aRelB-aRelE复合物的结构解析为2.3 Aring;的分辨率。复合物晶体的空间群是P21212，具有两个不对称的结晶学独立配合物单元。不对称单元中的这两个配合物（A和B）在蛋白质的总折叠和配合物中的分子接触方面是相同的。aRelB-aRelE复合物的最终模型包含aRelE分子的90个残基的88个残基（1-88），以及aRelB分子的67个残基的61个残基（7-67）。此外，最终模型中包括35个水分子。

aRelB和aRelE的结构

在aRelB-aRelE复合物的结构中，aRelB作为缺少任何不同疏水核心的多肽链存在，并且围绕一个aRelE缠绕超过一圈。aRelB的大多数多肽链与aRelE的表面残基接触。N端长alpha;-螺旋（alpha;1，残基8-28）沿着aRelE的beta;-片的尖端延伸。该螺旋alpha;1上的螺旋轮上的氨基酸序列显示出显着的疏水性氨基酸模式，例如亮氨酸和异亮氨酸。该结构特征表明螺旋alpha;1折叠成亮氨酸拉链基序样结构，并且可能参与aRelB的二聚化，如下所述。在Pro29处，aRelB的多肽链改变其方向并且环延伸至Glu34。第二个alpha;-螺旋从Thr37开始，到Arg49结束;它沿着凹面浮动aRelE的beta;-片。结构由两个螺旋完成（alpha;3和alpha;4）插入一条短的alpha;-链，beta;0，形成一个双链反平行的beta;-片，在aRelE中具有N-末端-链beta;1。

该复合物中的aRelE结构为椭圆体，分子尺寸约为40times;26times;30 Aring;，由三个alpha;-螺旋（alpha;1-alpha;3）和五股beta;-片组成。连续四个beta;-链（beta;2-beta;5）反向平行，而beta;1平行于相邻的beta;链并形成五链混合beta;-片。这个beta;-片和两个长alpha;-螺旋（alpha;1和alpha;2）平行运行，在它们之间形成疏水核心。该核心包括在alpha;-螺旋处的残基Tyr23，Phe26，Phe29和Leu33，以及在beta;-片层处的Phe43，Val45，Leu61，Tyr64，Val66，Tyr68，Ile79和Leu82。特别是，alpha;-螺旋处的Phe29和Leu33与beta;-片上的Val45，Leu61和Val66的相互作用稳定了双向结构的构象。尽管这种简单的aRelE结构，使用Dali服务器在蛋白质数据库中进行结构同源性搜索显示aRelE结构与任何已知折叠之间没有显着的同源性。

通过局部双重对称性aRelB-aRelE在不对称单元中存在两个配合物表明该配合物在晶体中的二聚化。为了测试该假设，通过Sephacryl S-200上的凝胶过滤色谱法估计复合物的分子量为35 kDa，表明异四聚体（aRelB-aRelE）在溶液中是稳定的，并且代表aRelB-aRelE晶体的基本构建块。

aRelB和aRelE之间的交互

在形成复合物后，1,505 Aring;的溶剂可接触的表面区域被埋在aRelE界面处。该值与其他稳定蛋白质-蛋白质复合物的平均值一致。界面由几乎整个aRelB分子形成，其围绕着一个外表面aRelE的分子表面。界面处的相互作用主要是静电的。

在aRelB中的中心环和aRelE中的beta;-片之间观察到广泛的相互作用，其中离子相互作用稳定了复合物。相互作用的表面具有高度的电荷互补性：由aRelB的暴露环上的Glu31，Asp33，Asp35和Glu40的位置产生的负静电势与由aRelE中的Lys47，Arg58，Arg65和Lys81的聚集形成的正电性面有利地相互作用。该区域的离子相互作用如下：aRelB中的Glu31与aRelE中的Lys47相互作用； aRelB中的Asp33与aRelE中的Arg58和Arg65；aRelB中的Asp35与aRelE中的Arg65；aRelB中的Glu40和Glu40中的Lys81。特别地，aRelB中的Asp33与Arg58和Arg65的两个侧链相互作用。此外，Glu30与Gly50的主链氢键结合，Arg49与aRelE中的Asp55和Val70的主链氢键结合。

可能的功能部位

虽然已知RelE作为核糖体依赖性RNA酶起作用并优先在终止密码子UAG和UAA处切割，但详细的催化机制仍然模糊不清。为了深入了解RelE的结构-功能关系，我们使用了RelE家族蛋白中进化上保守氨基酸的丙氨酸扫描诱变。如方法中所述，将所有突变体aRelE蛋白纯化至表观同源性，并使用大肠杆菌无细胞系统以蛋白质合成抑制活性表征。Arg85的突变消除了蛋白质合成抑制活性。此外，Arg40，Leu48，Arg58和Arg65的突变适度降低了抑制活性。其他突变对蛋白质合成抑制活性几乎没有影响。Arg85位于C末端延伸结构上，而Leu48，Arg58和Arg65分别位于beta;2，beta;3和beta;4链上。将这四个残基映射到aRelE结构上表明它们位于结构的一个面附近。此外，位于alpha;3螺旋上的Arg40位于结构内靠近四个残基的位置。因此，aRelE可能在beta;-sheet的一个面上具有功能性部位。

讨论

这里描述的aRelB-aRelE复合体的结构是RelB-RelE家族成员的第一个结构。在复合物中，aRelB广泛地包裹着一个aRelE的分子表面。RelB同源物的序列比对显示这些蛋白质比RelE同源物更加不同。实际上，参与aRelB-aRelE相互作用的氨基酸在RelE蛋白中是保守的，但通常在RelB蛋白中被取代。因此，在aRelB-aRelE界面中观察到的相互作用在其他RelB和RelE蛋白中可能不是保守的。特别是带负电荷的氨基酸Asp33和Asp35，它们与aRelE中的Arg58和Arg65的盐桥相关，取代了大肠杆菌RelB蛋白中的亮氨酸和酪氨酸。然而，aRelB的N-和C-末端螺旋与aRelE的相互作用主要涉及来自aRelB的主链的氢键，因此它们的相互作用不依赖于它们的氨基酸序列。因此可以假设aRelB的N-和

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